一种分离培养肿瘤细胞的消化液的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种分离培养肿瘤的消化液，其配方为：将金属骨架化合物均苯三甲酸铜，化学式Cu3(BTC)2(H2O)3· x H2O又名（MOF-199或HKUST-1）按照1mg/mL的重量/体积比加入到磷酸缓冲液（PBS）中混匀。本发明消化液具有能有效分解肿瘤细胞间连接成分的功效。细胞经本发明消化液作用后，细胞悬液分散度好、细胞膜损伤小，且操作方便、效果稳定。
【专利说明】一种分离培养肿瘤细胞的消化液
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物细胞培养分离【技术领域】，尤其涉及一种用于分离肿瘤细胞的消化液。
【背景技术】
[0002]在对肿瘤细胞生物学特性进行分析研究时，首先需将样品制备成分散的单细胞悬液。分离培养肿瘤细胞的传统方法是:用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化细胞10分钟左右，消化结束后加入含血清或蛋白酶抑制剂的培养基，中和残留的胰蛋白酶，然后用移液管吹打分散细胞。但因为胰蛋白酶自身具有的引起细胞团聚不足之处，细胞不易形成稳定的单细胞悬液，从而影响到后续的实验观察；其次，在大规模工业化细胞培养中，生物反应器中也多采用0.25%胰蛋白酶液来消化培养细胞，消化结束后通过振动的方法将细胞从载体上分离下来。这种消化方法的不足是很难得到单分散的种子细胞，很多细胞以细胞团的形式存在，不利于细胞的均匀分布，影响了细胞在下级反应器培养中的生长。细胞悬液质量的好坏与消化液配方和消化方法密切相关。现有技术中的消化液对肿瘤细胞的消化效果还有待改进。
[0003]天然酶是一种生物催化剂，结构复杂，价格昂贵，且易变性失活。而无机纳米粒子模拟酶结构比天然酶简单，化学性质稳定，具有酶的功能，还有高效、高选择性和价廉易得等优点。金属有机骨架材料(MOFs，也称为金属有机分子筛)是一种类似沸石分子筛的轻质材料，其具有自组装的活性中心、较大的比表面积和孔隙率及其结构的可调控性、高渗透性等特性，可满足催化、分离、能量储藏与释放的需要。目前关于这一材料的模拟酶研究正处于探索阶段，相关报道还极为缺乏，且已报道的几例主要侧重于过氧化氢酶的模拟研究，尚无见模拟胰酶的报道。本发明报道了 M0F-199可以模拟胰蛋白酶消化液的作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种能有效、快速将肿瘤细胞样品分散为单细胞悬液的消化液。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于分离肿瘤细胞的模拟酶消化液，所述消化液为0.1 % M0F-199磷酸缓冲液。
[0005]本发明发现，0.1 % M0F-199消化液与肿瘤细胞作用后，90 %以上贴壁细胞可以成功脱落并分散开，在不使用乙二胺四乙酸(EDTA)的条件下得到稳定的单细胞悬液；本发明还发现，在抽出消化液后，细胞能正常生长传代。
[0006]本发明的有益效果是:1.消化液成分简单，方便使用。2.能够有效分离90%以上的贴壁细胞。3.能够有效防止细胞团聚，形成稳定的单细胞悬液，为下一实验奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为本发明消化液组与对胰酶组消化A549肺癌细胞效果对比图。
[0008]图2为本发明消化液组消化的A549肺癌细胞24 h后的生长形态图。(a, d)对照组；b, 0.1% MOF-199 作用 10 min ；c, 0.25% Trypsin-0.02%EDTA作用 2 min ；e, 0.1%MOF-199作用后用完全培养基恢复培养24 h ；f, 0.25% Trypsin-0.02%EDTA消化后用完全培养基恢复培养24 ho
【具体实施方式】
[0009]本实施例按组成成分设计下述三个实验组，每组针对同样量的贴壁肿瘤细胞进行消化。1.消化液组:0.1 % M0F-199磷酸缓冲液。2.胰酶组:0.25 %胰蛋白酶+0.02%EDTA。3.对照组:正常细胞。
[0010]参见图1所示，同样量的A549贴壁细胞经消化液组消化10 min后,细胞皱缩变圆，细胞间隙增大，部分细胞漂浮。90%以上贴壁肿瘤细胞脱落并分散开，形成稳定的单细胞悬液。
[0011]参见图2所示，用消化液组消化得到的细胞，用完全培养基(其组成成分:胎牛血清20%，青霉素100 IU/mL，链霉素100 μ g/mL，DMEM补充到100 %)培养，细胞能继续生长，仍能具有良好形态，并可继续传代。恢复培养后的细胞形态与对照组相似。
【权利要求】
1.一种肿瘤细胞消化液，其特征在于，使用M0F-199替换传统胰蛋白酶消化液中的胰蛋白酶和乙二胺四乙酸成分。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞消化液,肿瘤细胞消化液组成成分为M0F-199按照1 mg/mL的重量/体积比加入到磷酸缓冲液中混匀后，即得所述肿瘤细胞消化液。
3.权利要求1所述的肿瘤细胞消化液在消化培养肿瘤细胞中的用途，其特征在于:所述肿瘤细胞消化液可以防止消化后的肿瘤细胞团聚，得到稳定的单细胞分散液。
【文档编号】C12N5/09GK104371975SQ201410586787
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】李斌, 陈道梅, 王家强 申请人:云南大学