一种高通量环状rna测序的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高通量环状RNA测序的方法，属于分子生物学领域。该方法包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除标记上生物素的套索RNA及线性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的线性RNA，得到第四混合物；对第四混合物进行标准的高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。本发明能够准确反映出生物体内的基因在特定条件下的表达情况，降低了的成本。
【专利说明】-种高通量环状RNA测序的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量环状RNA测序的方法。
【背景技术】
[0002] 生物体内大部分的RNA为线性，但有少部分RNA首尾连接形成环状，被称为环状 RNA。早在1980年，环状RNA就首次被发现，但是30年来，由于研究方法的限制，人们对于环 状RNA的了解知之甚少，直至近年来，随着高通量测序技术的高速发展，并结合生物信息学 的方法，大规模的转录组数据被深入挖掘，研究者们从中发现了大量的环状RNA信息，从而 使得环状RNA迅速成为RNA世界研究的新热点，继而衍生出了有针对性的环状RNA测序，这 也极大地加快了对环状RNA的发现及对环状RNA功能的分析。在现有的高通量转录组测序 中，通过在样本中混入外源转录本作为参考，可以直接评估差异表达基因的检测的灵敏度、 高通量测序文库的质量及基因表达倍数变化。
[0003] 研究环状RNA的前提是将环状RNA从生物体内分离出来，目前还没有直接从生物 体内获取环状RNA的方法，只能从总RNA中去除线性RNA，间接达到富集环状RNA的目的。 在现有的研究方法下，虽然能够对线性RNA分子进行消化，但是效果并不明显，从环状RNA 的测序数据中可见，仅仅只有不到1 %是环状RNA分子的序列，而其余的99 %都是无用的数 据。要获取足够分析环状RNA的有效数据量，单个样本的测序数据量需要达到100M，这对于 高通量测序而言，仍然是个非常庞大的数字，这也意味着巨额的人力物力财力的投入。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中总RNA中的环状RNA无法准确测序的问题，本发明实施例提 供了一种高通量环状RNA测序的方法。所述技术方案如下 ：
[0005] 本发明实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法，所述方法包括：
[0006] 人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA ;
[0007] 对所述外源环状ERCC-OO13-RNA进行质量控制；
[0008] 将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混 合，得到混合外源RNA ;
[0009] 向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA 的质量比为2000:1，得到第一混合物；
[0010] 去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；
[0011] 对所述第二混合物进行3'末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及 线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA， 得到第三混合物；
[0012] 去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；
[0013] 对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。
[0014] 具体地，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，包 括：
[0015] 选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序 列表中SEQ ID NO: 1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0016] 将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体 中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；
[0017] 将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行 体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA ;
[0018] 去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸结构，并将所述外源线性 ERCC-0013-RNA的5'端修饰羟基；
[0019] 对5'端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5'端经 磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA ;
[0020] 将所述5'端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端连接；
[0021] 去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状 ERCC-OO13-RNA。
[0022] 进一步地，所述待测序样本的基因中不存在与所述外源ERCC-0004基因和所述外 源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。
[0023] 进一步地，对所述外源环状ERCC-OO13-RNA进行质量控制，包括：
[0024] 利用随机引物对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外源 ERCC-OO13-cDNA，所述外源ERCC-OO13-cDNA包括外源线性ERCC-OO13-cDNA和外源环状 ERCC-OO13-cDNA ；
[0025] 利用第一引物和第二引物分别对所述外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量PCR扩 增，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于扩增所述外源线性 ERCC-0013-cDNA和所述外源环状ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于扩增所述外源环状 ERCC-OO 13-cDNA，通过所述第一引物扩增获得CtI值，通过所述第二引物扩增获得CT2值；
[0026] 通过CtI值和CT2值以及公式2 [CT2_CT1] X 100 %，计算合成的所述外源环状 ERCC-0013-RNA的环化比例，并选用环化比例超过90%的所述外源环状ERCC-0013-RNA。
[0027] 具体地，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的线性RNA。
[0028] 具体地，向所述待测序样本的总RNA中，加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述 混合外源RNA的质量比为2000:1。
[0029] 进一步的，采用RNA酶R去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA。
[0030] 具体地，采用链霉亲和素磁珠去除被标记上所述生物素的套索RNA及所述线性 RNA。
[0031] 具体地，所述生物学分析包括：获得所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环 状ERCC-0013-RNA的相对比例、以及以所述外源环状ERCC-0013-RNA为参考分析所述待测 序样本中的环状RNA基因表达变化。
[0032] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种高通 量环状RNA测序的方法，模拟真核生物内源转录本的特征，用于评估RNA测序工具的系统性 能，及基因差异表达的检测灵敏度，通过加入人工合成的外源线性RNA与环状RNA，可以为 环状RNA的表达量提供一个外源环状RNA参考基因，通过外源环状RNA的表达量，可以计算 样本中内源基因的表达量变化倍数，从而更准确的反映出生物体内的基因在特定条件下的 表达情况；此外，通过对具有3'未端的RNA进行生物素标记，之后再利用链霉亲和素磁珠捕 获被标记上生物素的RNA的方法，进一步去除线性RNA和套索RNA，提高了样品中环状RNA 的富集度，减少单个样本的环状RNA测序数据量，比常用的环状RNA高通量测序方法效率提 高了 14倍多，大幅的降低了高通量测序的成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将结合附图对实施例描述中 所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
[0034] 图1是本发明实施例提供的高通量环状RNA测序的方法流程图；
[0035] 图2是本发明实施例提供的现有的环状RNA测序的方法流程图。
【具体实施方式】
[0036] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。本方案中未特别说明的试剂均为常用市售试剂，且不同市售试剂效果差异 不大。
[0037] 实施例
[0038] 本发明实施例提供了一种环状RNA测序的新方法，本发明实施例提供的待测序 样本为莱茵衣藻，且该莱茵衣藻的品系为CC503(购自于衣藻资源中心，网址为：http:// chlamycollection. org/)，如图1所示，具体方法包括：
[0039] 步骤100 :人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA。已有的 环状RNA测序中是采用一个外源线性RNA作为参照（阴性参照）。本发明实施例中，人工合 成了外源环状RNA与外源线性RNA，按比例加入总RNA后作为参照，以模拟体内稳定表达的 内源环状RNA与内源线性RNA。本发明实施例提供的外源环状RNA与外源线性RNA在待测序 样本中没有相同序列或同源性较高的序列，因为一旦加入总RNA中之后，是无法将外源RNA 与内源RNA区分开的，若二者存在重叠，将导致结果不准确。此外，外源基因长度也不能过 长，否则影响环化效率。本发明实施例将RNA对应的DNA序列转入质粒中，通过质粒增殖而 增加相应的DNA的量,从而灵活获得大量DNA序列，再通过体外转录,将质粒上的DNA转录 为RNA。为此，在该DNA序列前端添加了体外转录启动子序列。因转录成的RNA需要纯化， 所以在DNA的末端设计了寡聚T，转录后形成寡聚A尾巴，寡聚A可用于纯化RNA。合成的 外源RNA是线状，需要环化后才能成为环状RNA。由于合成时的RNA的5'端为三磷酸基团， 连接时需要单磷酸基团，为此，在去掉了外源RNA的三磷酸基团后，省去了加上单磷酸基团 这一步，从而合成能够环化成环状的前体RNA的状态。具体操作步骤如下：
[0040] 1、选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，该外源ERCC-0004基因如序 列表中SEQ ID NO: 1所示，该外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
[0041] 上述SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 2及其互补链由生工生物工程（上海）股份有限公 司合成。
[0042] 通过NCBI的BLAST程序检索，没有发现生物中存在外源ERCC-0004基因和外源 ERCC-0013基因、以及与外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的同源基因。选择的 外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的长度不超过lOOObp。分别在外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因的5'端和3'端分别添加了 ctcgag和aagctt序列，该ctcgag 和aagctt序列分别为限制性内切酶Xho I和Hind III的酶切位点，便于将外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因克隆进入原核表达载体，外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013 基因的5'端的taatacgactcactata序列为T7转录酶的启动子序列，其余序列为可转录的 序列。在taatacgactcactata序列之后连接有ggg序列，ggg序列能够增加 T7转录酶的转 录效率。
[0043] 2、将外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中，获 得克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因，包括 ：
[0044] 所选用的克隆载体为pBluescript II SK(+)(该克隆载体从长沙赢润生物技术有 限公司购买，货号为VKS0288)，采用内切酶Xho 1(购买自NEB公司，货号为R0146)和内切 酶Hind 111(购买自NEB公司，货号为R0104)对pBluescript II SK(+)载体进行双酶切。 具体地，在20 μ 1的反应体系中，包含有10 μ g pBluescript II SK(+)载体、20U的内切酶 Hind III、20U的内切酶Xho I和2X的NEBuffer2. 1(由NEB公司提供）。将上述反应体 系混合均匀，经短暂离心，于37°C保温1小时后，经80°C，20分钟将酶失活，纯化获得线性 pBluescript II SK(+)载体，该线性 pBluescript II SK(+)载体的浓度为 0.5 μ g/μ 1。
[0045] 将外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因用无菌水溶解后，分别配制成浓度 为0. 5 μ g/ μ 1的溶液，将外源ERCC-0004基因及其互补链按体积比I : 1混合均匀，于PCR 仪中依次经历94°C 10分钟；65°C 10分钟和37°C 10分钟，形成外源ERCC-0004-双链DNA 基因；将外源ERCC-0013基因及其互补链按相同的方法进行处理，获得外源ERCC-0013-双 链DNA基因。
[0046] 在20 μ 1的反应体系中包括线性的pBluescript II SK(+)载体10 μ 1、外源 ERCC-0004-双链DNA基因1 μ 1、T4DNA连接酶（购买自NEB公司，货号为M0202)400U和 1XT4DNA连接酶缓冲液（随T4DNA连接酶一起购买自NEB公司），16°C温育过夜后，65°C 10 分钟，使T4DNA连接酶热失活，获得含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒 载体。按同样的方法，获得含有外源ERCC-0013基因的pBluescript II SK(+)质粒载体。
[0047] 利用热激法将含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体转化 进入大肠杆菌，具体方法如下：取50 μ 1感受态细胞（由北京全式金生物技术有限公司生 产，目录号为CD501)在冰浴中缓慢解冻，加入含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体，轻轻混匀，在冰浴上孵育30分钟，42°C热激30秒，快速转移至冰浴中冰浴 3分钟，该过程中不要摇动离心管，然后加入300 μ 1不含抗生素的无菌LB液体培养基（LB 液体培养基成份：牛肉膏〇. 5g，蛋白胨I. 0g，氯化钠0. 5g，蒸馏水lOOmL，ρΗ7. 2?7. 5)，于 37°C，200转/分钟，复苏1小时，取复苏后的菌液200 μ 1均匀涂布于含氨苄青霉素抗性的 LB固体培养基（LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼 脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37°C恒温培养箱中，暗培养过夜。挑取LB固体培 养基上长出来的单克隆至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经37°C，200转/分钟，摇 菌扩增繁殖6-8小时，获得的菌液用于提取质粒。
[0048] 利用天根生化科技（北京）有限公司生产的快速质粒小提试剂盒（货号为DP105) 从上述菌液中，提取并纯化含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体的 DNA，提取与纯化的方法按照随试剂盒提供的说明书进行。利用分光光度计（美国Quawell 公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA程序，检测纯化后的pBluescript II SK(+)质粒的 质量浓度。利用外源ERCC-0004基因的PCR引物从纯化后的pBluescript II SK(+)质粒 上扩增外源ERCC-0004基因。具体地，20 μ 1的扩增体系包括：纯化后的pBluescript II SK⑴质粒50ng、10 μ I Q5高保真扩增混合物（购自于NEB公司，货号为M0492)和10 μ M的 外源ERCC-0004基因的PCR引物（该PCR引物为正向引物与反向引物的混合物）。扩增程 序如下：98°C，30秒；（98°C，8秒；56°C，20秒；72°C，20秒）X 30个循环。将PCR产物利用乙 醇沉淀进行纯化，纯化产物溶解于10 μ 1无核酸酶的水中，获得外源线性ERCC-0004基因的 PCR产物，利用Q5000 (美国Quawel 1公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA定量程序对PCR 产物进行定量检测，检测结果表明：本次扩增获得的外源线性ERCC-0004基因的PCR产物浓 度为610ng/μ 1。扩增产物送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认克隆的ERCC-0004的 正确性，从而获得含有正确克隆外源ERCC-0004基因的Bluescript II SK(+)质粒与外源 线性ERCC-0004基因的PCR产物。按同样的方法，获得含有正确克隆外源ERCC-0013基因 的Bluescript II SK(+)质粒与外源线性ERCC-0013基因的PCR产物。
[0049] 其中，外源ERCC-0004基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID N0:7所示， 外源ERCC-0004基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；外源ERCC-0013 基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID N0:7所示，外源ERCC-0013基因的PCR引 物的反向引物如序列表中SEQ ID N0:9所示。其中，SEQ ID N0:7与SEQ ID N0:9中的多 聚T序列是为了在转录时获得多聚A，用于模拟生物RNA的多聚A尾巴，多聚A尾巴可用于 RNA的逆转录和纯化。
[0050] 3、将克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因通过体外转录，合成外源线性 ERCC-0004-RNA 和外源线性 ERCC-0013-RNA，包括：
[0051] 采用T7RNA快速高效合成试剂盒（购自于NEB公司，货号为E2050)转录合成外源 ERCC-0004-RNA。该试剂盒中的成份包括：无核酸酶的水、含有NTP的缓冲液混合物和T7RNA 聚合酶混合物。反应体系中包括：1 μ g上述外源线性ERCC-0004基因的PCR产物、10 μ 1 含有NTP的缓冲液混合物和2 μ I T7RNA聚合酶混合物，加水补足20 μ 1混合均匀，并短暂 离心，经37°C保温2小时后，加入30μ1无酶水和2μ1 DNase 1(购自于NEB公司，货号为 Μ0303)，混合均匀后，经37°C保温15分钟，去除DNA模板。再利用Dynabeads mRNA纯化试 剂盒（由Life technologies公司生产，货号为61006)进行纯化，并用50 μ 1无核酸酶的 水溶解纯化产物，获得纯化的外源线性ERCC-0004-RNA。采用同样的方法，获得纯化的外源 线性 ERCC-OO13-RNA。
[0052] 4、去除外源线性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸结构，并在外源线性 ERCC-0013-RNA的5'端修饰羟基。因体外合成的外源线性ERCC-0013-RNA的5'端为三磷 酸结构，使得外源线性ERCC-0013-RNA的5'端无法与3'端连接形成环状，所以必须去除该 5'端的三磷酸结构，再在5'端加上单磷酸结构，这样才能使得外源线性ERCC-0013-RNA的 首尾相连成环状，具体步骤包括：
[0053] 采用小牛肠碱性磷酸酶（购自于NEB公司，货号为M0290)去除外源线 性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸结构。反应体系如下：20 μ g纯化的外源线性 ERCC-0013-RNA和7U的小牛肠碱性磷酸酶，用水补足20 μ 1后混合均匀，经短暂离心，于 37°C保温1小时，获得去除5'端的三磷酸结构的外源线性ERCC-0013-RNA。利用Dynabeads mRNA纯化试剂盒（由Life technologies公司生产，货号为61006)纯化去除5'端的三磷 酸结构的外源线性ERCC-0013-RNA，得到5'端为羟基的外源线性ERCC-0013-RNA。
[0054] 5、对5'端修饰羟基的外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5'端磷酸 化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA，包括：
[0055] 利用T4PNK激酶（由NEB公司，货号为M0201)修饰该5'端为羟基的外源线性 ERCC-0013-RNA。随酶一起提供的有10 X T4PNK激酶缓冲液。在50 μ 1的反应体系中，包含如 下成份：1ΧΤ4ΡΝΚ激酶缓冲液、ImM ATP、10U Τ4ΡΝΚ激酶、以及上述获得的5'端为羟基的外 源线性ERCC-0013-RNA，用水补足至50 μ 1并混合均匀，经短暂离心，于37°C保温30分钟。 利用Dynabeads mRNA纯化试剂盒（由Life technologies公司生产，货号为61006)进行纯 化，操作方法按该试剂盒的说明书进行，获得5'端磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA。
[0056] 6、将5'端磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端连接，合成外源 环状 ERCC-0013-RNA，包括：
[0057] 利用T4RNA连接酶I(NEB公司生产，货号为M0204)对该5'端磷酸化修饰的外源线 性ERCC-0013-RNA的5'端与3'端进行连接。随该T4RNA连接酶I 一起提供的成份还包括： 10XT4RNA连接酶反应缓冲液、10mMATP、10U/μl的RNA酶抑制剂和PEG8000。在20μl的 反体系中包含如下成份：1XT4RNA连接酶反应缓冲液、lOU/μ 1的T4RNA连接酶1μ IUOU/ μ 1的RNA酶抑制剂0. 5 μ 1、浓度为10%的PEG8000、20-50 μ M的ATP和上述获得的5'端 磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA，用水补足20 μ 1并混合均匀，经短暂离心，于PCR仪 中于16°C过夜，经95°C 2分钟终止反应，得到外源环状ERCC-0013-RNA。
[0058] 纯化外源环状ERCC-0013-RNA，具体地，向得到的含有外源环状ERCC-0013-RNA 的混合物中加入以下成份：5M的醋酸铵（Life technologies公司生产，货号为 AM9071) 10 μ 1、无水乙醇200 μ 1和水80 μ 1，混合均匀，经短暂离心，置于-80°C冰箱（海尔 公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟；取出后经14000rpm，4°C，离心25分钟，用移 液器的枪头小心吸去上层清液，向沉淀中加入700 μ 1浓度为70 %的乙醇，用于清洗沉淀， 再经14000rpm，4°C，离心5分钟后吸去上层清液，于室温下干燥10分钟，用于去除残留的乙 醇，再用1〇μ 1无核酸酶的水溶解沉淀，获得纯化的外源环状ERCC-0013-RNA。
[0059] 7、采用RNA酶R切掉未环化成功的外源线性ERCC-0013-RNA。具体步骤包括：
[0060] 在获得的纯化的外源环状ERCC-0013-RNA中，还有部分未环化成功的外源线性 ERCC-0013-RNA，采用RNA酶R(由Epicentre公司生产，货号为RNR07250)消化未环化成功 的外源线性ERCC-0013-RNA。随该RNA酶R -起提供的还有10 X RNA酶R反应缓冲液，向获 得的纯化的外源环状ERCC-0013-RNA中加入2μll0XRNA酶R反应缓冲液、lμl20U/μl的 RNA酶R和7 μ 1无核酸酶的水，并混合均勻，经短暂离心后于40°C保温1小时，获得去除了 外源线状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA。
[0061] 8、纯化去除了外源线状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA，包括：
[0062] 向获得的去除了外源线状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA中加入以下 成份：5M的醋酸铵（Life technologies公司生产，货号为AM9071) 10 μ 1、无水乙醇200 μ 1 和水80μ 1并混合均匀，经短暂离心，置于-80°C冰箱（海尔公司生产，型号为DW-86L626) 中放置30分钟，取出后经14000rpm，4°C，离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液， 向沉淀中加入700 μ 1浓度为70 %的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm，4°C，离心5分钟 后吸去上层清液，于室温下干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，用50 μ 1无核酸酶的水溶解 沉淀，获得纯化的外源环状ERCC-OO13-RNA。
[0063] 步骤200 :对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制。即使是采用了以上去 除线性ERCC-OO13-RNA的步骤，外源环状ERCC-OO13-RNA中仍然可能混有外源线状 ERCC-0013-RNA，因此需要对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制。具体步骤包括：
[0064] 1、利用随机引物对合成的外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外源 ERCC-OO 13-cDNA，外源 ERCC-OO 13-cDNA 包括外源线性 ERCC-OO 13-cDNA 和外源环状 ERCC-0013-cDNA，具体步骤如下：
[0065] 利用分光光度计（美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定量程序，测定 并获得上述纯化的外源环状ERCC-OO13-RNA的质量浓度，本发明实施例提供的外源环状 ERCC-0013-RNARNA 的质量浓度为 8. 99ng/y 1。
[0066] 取纯化的外源环状ERCC-0013-RNA0. 1 μ g，与下列成分混合：5 μ 1浓度为1 μ M的 6碱基随机逆转录引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、2 μ 1浓度为IOmM 的dNTP、20U的逆转录酶（美国Life technologies公司生产，货号为18064-014)、5 μ 1 浓度为IOOmM的DL-二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT，随逆转录酶一起由美国Life technologies公司提供）和10 μ 15X逆转录反应缓冲液（随逆转录酶一起由美国Life technologies公司提供），用水补足至50 μ 1混匀后，经42°C保温2小时，75°C保温15分 钟，使酶失活，合成外源ERCC-OO 13-cDNA。
[0067] 2、利用第一引物和第二引物分别对外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量PCR扩增， 第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所 示的第一反向引物，第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引物和如序列 表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，第一引物用于扩增外源线性ERCC-0013-cDNA和外 源环状ERCC-0013-cDNA，第二引物用于扩增外源环状ERCC-0013-cDNA，通过第一引物扩增 获得C tI值，通过第二引物扩增获得CT2值。
[0068] 其中，第一引物的扩增产物不跨越外源环状ERCC-0013-RNA的环化连接点，使得 该第一引物可扩增外源线性ERCC-0013-cDNA，又可扩增外源环状ERCC-0013-cDNA ;第二引 物或其扩增产物跨越外源环状ERCC-0013-RNA的环化连接点，使得该第二引物只能扩增外 源环状 ERCC-OO 13-cDNA。
[0069] 其中，第一引物和第二引物分别在两个反应体系中平行进行，且反应体系和反应 条件均相同，仅引物不同。具体地，取2μ 1外源ERCC-0013-cDNA、3l·! 1浓度为IyM的第一 引物、10 μ 1定量PCR混合物（由Toyobo公司生产，货号为QPS-201)和0.4 μ 150倍的ROX 荧光校正染料（由Toyobo公司随QPS-201 -起提供）混合均匀后，经短暂离心，在Life technologies StepOne实时定量PCR仪中按如下扩增程序进行实时定量PCR扩增：95°C 20 秒；95°C 3秒，60°C 20秒，共40个循环，在每一次循环的最后一步收集突光信号，该突光信 号的强弱用于衡量表达量的多少。
[0070] 3、通过CtI值和CT2值以及公式2|('「 2_心1] X 100%，计算合成的外源环状 ERCC-OO13-RNA的环化比例，当环化比例超过90 %时，外源环状ERCC-OO13-RNA可以使用。
[0071] 通过第一引物扩增获得CtI值，该CtI值为21. 55;采用第二引物按同样的方 法进行扩增，获得CT2值，该CT2值为21. 45。将CtI值和CT2值代入公式计算外源环状 ERCC-0013-RNA 的环化比例为 Q1ri2-cilI X 1〇〇% =2丨21.45-2155I X 100% =93.30%。若外 源环状ERCC-OO13-RNA的环化比例超过90%，该外源环状ERCC-OO13-RNA可以使用，否则， 该外源环状ERCC-0013-RNA不能使用，需重新制备外源环状ERCC-0013-RNA。其中，90%的 环化比例作为外源环状ERCC-0013-RNA合格的标准仅作为经验值，该比例可根据具体情况 作出调整。
[0072] 步骤300 :将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按摩尔比1:1混 合，得到混合外源RNA。具体操作如下 ：
[0073] 利用Qubit RNA分析试剂盒（由Life technologies公司生产，货号为Q32852) 测定外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-OO13-RNA的质量浓度，测定方法按该试 剂盒的说明书进行。在本发明实施例中，检测获得的外源线性ERCC-0004-RNA和外源环 状ERCC-0013-RNA的质量浓度分别为13393pg/l·! 1和5298pg/l·! 1。利用网站工具（网 tit % ：http://www. basic, northwestern, edu/biotools/oli gocalc.html)计算夕卜源线 性 ERCC-0004-RNA 和外源环状 ERCC-0013-RNA 的分子量分别为 168246. 6 和 262445. 9， 通过分子量分别计算外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的摩尔浓度分 别为79603. 39pM和20187. 02pM，由此计算，若要求外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状 ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，那么，二者混合的体积比应该为I :3. 94。具体地，取外 源线性ERCC-0004-RNA10y 1与外源环状ERCC-0013-RNA39. 4μ 1混合均匀后，经短暂离 心，获得混合外源RNA。计算得到该混合外源RNA的摩尔浓度为32214. 62ρΜ，质量浓度为 6936.66pg/μ 1。
[0074] 步骤400 :向待测序样本（莱茵衣藻）的总RNA中加入该混合外源RNA，总RNA 与混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物。该第一混合物中既有外源环状 ERCC-OO13-RNA，又有外源线性ERCC-0004-RNA，模拟了内源环状RNA与内源线状RNA。 1/2000的混合比例既保证了有足够的外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA 可以检测，又不至于添加过多外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，占用测 序通量，以至于浪费高通量测序的检测成本。具体步骤包括：
[0075] 1、提取莱茵衣藻的总RNA :
[0076] 取正常生长和低温胁迫条件下处于对数生长期的莱茵衣藻5ml，且所取的莱茵衣 藻的数目少于4000万个，若超过4000万个，则相应减少取样体积，反之增加。4000rpm常温 离心1分钟，倒去上层的培养液后，利用Trizol试剂（由Life technologies公司生产，货 号为15596-018)提取莱茵衣藻的总RNA并溶解于50 μ 1无核酸酶的水中，总RNA的提取与 纯化的方法按照Trizol试剂的操作手册进行。
[0077] 利用分光光度计（分光光度计由美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定 量程序，测定并获得上述提取的莱茵衣藻的总RNA的质量浓度。在本实施例中，获得的正常 和胁迫的莱茵衣藻的总RNA的质量浓度分别为I. 52 μ g/μ 1和0.98 μ g/μ 1。由此计算，提 取的莱茵衣藻的总RNA的量分别为76 μ g和49 μ g。
[0078] 2、向提取的莱茵衣藻总RNA中加入混合外源RNA，包括：
[0079] 总RNA与混合外源RNA的质量比为2000:1，具体地，向正常的莱茵衣藻的总RNA中 加入38ng混合外源RNA，向胁迫的莱茵衣藻的总RNA中加入24. 5ng混合外源RNA，根据混合 外源RNA的质量浓度（6936. 66pg/ μ 1)计算，应加入的混合外源RNA的体积分别为5. 48 μ 1 和3. 53 μ 1，加入后混合均匀，经短暂离心，得到第一混合物，分别记正常的样本为Ν1，胁迫 处理的样本为Tl。
[0080] 步骤500 :去除第一混合物（NI和Tl)中的核糖体RNA，得到第二混合物（N2和 T2)。总RNA中绝大部分都是核糖体RNA (>95 % )，该核糖体RNA不是环状的RNA，因此，需要 消除。具体操作如下：
[0081] 利用植物核糖体RNA去除试剂盒（由Epicentre公司生产，货号为MRZPL116-6) 去除第一混合物中的核糖体RNA。
[0082] 该试剂盒包括：RNA酶抑制剂（100U/ μ 1)、核糖体RNA去除液、反应缓冲液、糖原 (10mg/ml)、醋酸钠（3Μ)、无核酸酶的水、磁珠和磁珠悬浮液。
[0083] 磁珠预处理：取225 μ 1磁珠，置于磁架上，并在室温下静置1分钟，用225 μ 1无核 酸酶的水清洗一次，用225 μ 1无核酸酶的水再清洗一次，将磁珠振荡悬浮于60 μ 1磁珠磁 浮液中，再加入1 μ 1糖原，得到经过预处理的磁珠。
[0084] 样品预处理：在40 μ 1的反应体系中，加入以下成分：5 μ g第一混合物、8-10 μ 1 核糖体RNA去除液和4 μ 1反应缓冲液，用水补足40 μ 1，混匀后经短暂离心，68°C保温10分 钟，取出后室温放置5分钟，得到经过预处理的样品混合物。
[0085] 去除核糖体RNA :向经过预处理的磁珠中加入经过预处理样品混合物，用移液器 的枪头吹打几次混匀，经短暂离心，于室温下保温5分钟，进行涡旋震荡，50°C保温5分钟， 置于磁架上，于室温下静置1分钟，取上清液至另一离心管中，即为去除核糖体RNA的混合 物。
[0086] 纯化样品：将去除核糖体RNA的混合物的体积用无核酸酶的水补足至180 μ 1，并 加入以下成份：3Μ的醋酸铵10 μ 1、糖原2 μ 1，无水乙醇600 μ 1，混合均匀，经短暂离心，置 于-80°c冰箱（海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟，14000rpm，4°C，离心25 分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，再加入700 μ 1浓度为70 %的乙醇，用于清洗沉 淀，再经14000rpm，4°C，离心5分钟后去除上层清液，于室温下干燥10分钟，用于去除残留 的乙醇，用10 μ 1无酶水溶解沉淀，获得纯化的去除了核糖体RNA的第一混合物，即第二混 合物（Ν2和Τ2)。
[0087] 步骤600 :对第二混合物（Ν2和Τ2)进行3'末端生物素标记，并用链霉亲和素磁 珠去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，线性RNA包括总RNA中的内源线性RNA和 外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物（Ν3和Τ3)，同时，回收未被标记上生物素的环状 RNA分子。在第二混合物中，混杂着各种类型的RNA，包括线性RNA、环状RNA、套索RNA及其 它具有特殊结构的RNA。套索RNA类似于环状RNA而功能却不同于环状RNA的分子，它由基 因间的内含子区形成，结构类似于环状，但是在其首尾相连的位置有一段裸露的3'端，形似 套索。在现有环状RNA测序的方法中，总RNA经核酸外切酶R消化之后，将套索RNA的3' 尾巴一并切除，形成一个完整的环，混入环状RNA中，导致在测序之前无法将环状RNA和套 索RNA分离，造成测序数据的浪费。这是现有环状RNA测序方法的一个明显的不足之处。
[0088] 针对环状RNA与其它RNA在结构上的差异，即环状RNA为一个封闭的环状，无裸露 的5'和3'末端，而线性RNA和套索RNA有裸露的3'末端。因此，通过将3'末端标记上生 物素，然后利用链霉亲和素与生物素之间的高度亲和力，通过链霉亲和素磁珠进行捕获，将 线性RNA和套索RNA从第二混合物中去除。具体包括：
[0089] 利用3'末端生物素标记用试剂盒（货号20160,购自美国Thermo公司），完成对第 二混合物的标记，具体方法如下：将第二混合物（N2和T2)真空浓缩至5 μ 1，向浓缩液中加 入浓缩体积的25 %的二甲基亚砜1. 25 μ 1，于85°C金属浴上变性5分钟，立即置冰上，同时， 在冰上配制混合物，该混合物包括：变性后的浓缩液，3 μ IlOX连接反应缓冲液，1 μ 1核酸 酶抑制剂，1 μ 1磷酸二异辛酯，2 μ I T4RNA连接酶，15 μ 130%聚乙二醇，3 μ 1无核酸酶的 水，总体积30 μ 1，混合均匀后，16°C保温过夜，得到过夜产物。
[0090] 向过夜产物中加入50μ 1结合缓冲液（该结合缓冲液包括：0. 5M NaCl、20mM Tris-HCl (PH7. 5)和ImM EDTA)，于65°C金属浴上变性5分钟，立即置冰上3分钟，得到变 性后的过夜产物。取100 μ 1链霉亲和素磁珠（货号S1420,购自NEB公司）于I. 5ml离心 管中，加入100 μ 1结合缓冲液，混匀，将离心管置磁架上分离1分钟，去除上清液，取下离心 管，加入100 μ 1结合缓冲液，混匀，将离心管置磁架上分离1分钟，去除上清液，取下离心 管，将变性后的过夜产物加入到该离心管中，混匀，室温孵育20分钟，并不时混匀。将离心 管置磁架上分离1分钟，收集上清液至另一新离心管中，约50 μ 1，即为去除被标记上生物 素的套索RNA及线性RNA，得到第三混合物。
[0091] 纯化去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，采用乙醇沉淀的方法进行纯化， 具体方法如下：向上述去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA的第三混合物中加入以 下成份：130 μ 1无核酸酶的水，3Μ的醋酸铵18 μ l、10mg/ml的糖原2 μ 1，无水乙醇600 μ 1， 混合均匀，经短暂离心，置于_80°C冰箱（海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分 钟，14000rpm，4°C，离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，加入700μ 1浓度为 70 %的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm，4°C，离心5分钟后去除上层清液，于室温下干 燥10分钟，用于去除残留的乙醇，用1〇μ 1无核酸酶的水溶解沉淀，获得了纯化的去除了被 标记上生物素的套索RNA及线性RNA的第三混合物。
[0092] 步骤700 :进一步去除第三混合物（Ν3和Τ3)中残留的线性RNA，得到第四混合物 (Ν4和Τ4)。经过3'末端标记及链霉亲和素磁珠捕获去除非环状RNA之后的第三混合物中 仍然会残留一部分线性的RNA，因此需要有针对性的处理线性的RNA分子，具体包括：
[0093] 利用核酸外切酶R(货号为RNR07250,购自Epicentre公司）能够酶切消化线性 RNA的特性，去除第三混合物中残留的线性RNA。随核酸外切酶R -起提供的还有10 X RNA 酶R反应缓冲液。向纯化后第三混合物中加入2 μ 110 X RNA酶R反应缓冲液、1 μ 120U/μ 1 的RNA酶R和无核酸酶的水7 μ 1，混合均匀，经短暂离心后40°C保温1小时，得到了去除残 留的线性RNA的第三混合物。
[0094] 纯化去除残留的线性RNA的第三混合物：将上述去除残留的线性RNA的第三混 合物用无核酸酶的水补足至180 μ 1，并加入以下成份：3M的醋酸铵10 μ 1，10mg/ml的糖 原2μ 1，无水乙醇600μ 1，混合均匀，经短暂离心，置于-80°C冰箱（海尔公司生产，型号为 DW-86L626)中放置30分钟，14000rpm，4°C，离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清 液，加入700 μ 1浓度为70%的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm，4°C，离心5分钟后去除 上层清液，于室温下干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，用1〇μ 1无核酸酶的水溶解沉淀， 获得了纯化的去除了残留的线性RNA的第三混合物，即第四混合物（M和Τ4)。
[0095] 步骤800 :对第四混合物进行高通量转录组测序。如图2所示，设置对照组，将莱 茵衣藻按现有的环状RNA测序方法进行平行测序。该方法包括：
[0096] 步骤101 :提取莱茵衣藻总RNA ;步骤201 :向莱茵衣藻总RNA中按2000:1的质量 比加入混合外源RNA，得到第一混合物；步骤301 :去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第 二混合物；步骤401 :去除第二混合物中的线性RNA，该线性RNA包括总RNA中的内源线性 RNA和外源线性ERCC-0004-RNA，得到混合物CKl ;该混合物CKl与本发明实施例提供的第 四混合物（M和Τ4)均按标准的高通量Proton转录组测序方法进行测序。本发明实施例 中每个样本测序的总数据量均为IOM。
[0097] 对测序数据进行生物学分析，其中测序数据从以下几个方面分析：通过分析第四 混合物M (胁迫处理的样本）中外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA在测 序数据中的绝对量，评估文库质量。具体地，本发明实施例提供的第四混合物M中外源线 性 ERCC-0004-RNA 的 Reads 数分别为 506,外源环状 ERCC-0013-RNA 的 Reads 数为 5672,而 外源混合RNA中外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA是按等摩尔比混合 的，由此可见，该文库的制备方法能够有效去除线性RNA分子。
[0098] 以外源环状ERCC-0013-RNA为参考，分析待测序样本中的环状RNA基因表达变化， 具体地，分析正常生长和低温胁迫下的两个样本中的外源环状ERCC-0013-RNA的表达变化 倍数，根据此变化倍数，计算内源环状RNA的表达差异。具体地，分析正常生长和低温胁迫 下的两个样本中某个特定的环状RNA基因相对外源环状ERCC-0013-RNA的表达变化倍数， 分析低温胁迫对基因表达水平的影响。在第四混合物M和T4的测序结果中均发现了特定 的环状RNA基因 circ_000026环状RNA基因的表达。其中，在第四混合物M中外源环状 ERCC-0013-RNA 的 Reads 数为 5672, circ_000026 的 Reads 数为 1146 ;在第四混合物 T4 中外 源环状ERCC-0013-RNA的Reads数为4218, circ_000026的Reads数为350 ;由此计算该环 状RNA circ_000026在低温胁迫条件下表达量相对正常生长下的变化倍数为（350/4218)/ (1146/5672) = 0. 41，即在低温胁迫条件下环状RNA基因 circ_000026表达下调了 1/0. 41 =2. 4倍。以此可以类推分析其它环状RNA的表达变化倍数，从而可以进一步分析胁迫条 件下环状RNA的调控机制。
[0099] 此外，对比分析本发明实施例获得的第四混合物M与现有方法获得的混合物CKl 测序数据中环状RNA的数据量。本发明实施例的测序数据经生物信息学分析之后的结果见 表1，混合物CKl测序的结果中，环状RNA获得的reads比例是0. 0056%，而第四混合物N4 获得的reads比例是0.0787%，对比之下，本发明实施例提供的方法能够将样本中的非环 状RNA进一步去除，使得环状RNA的有效测序数据量提高了 14倍，由此可证明本发明实施 例所用的方法能显著的将样本中的环状RNA进一步富集，这将大幅度降低环状RNA测序数 据量，降低成本，减少人力物力的浪费。
[0100] 表1.混合物CKl和第四混合物M的测序数据经生物信息学分析
[0101]
【权利要求】
1. 一种高通量环状RNA测序的方法，其特征在于，所述方法包括： 人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA ; 对所述外源环状ERCC-OO13-RNA进行质量控制； 将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得 到混合外源RNA ; 向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质 量比为2000:1，得到第一混合物； 去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物； 对所述第二混合物进行3'末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性 RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到 第三混合物； 去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物； 对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和 外源环状ERCC-0013-RNA，包括： 选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表 中SEQ ID NO: 1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示； 将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中， 分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因； 将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行体外 转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA ; 去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸结构，并将所述外源线性 ERCC-0013-RNA的5'端修饰羟基； 对5'端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5'端经磷酸 化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA ; 将所述5'端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端连接； 去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状ERCC-0013-RNA。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测序样本的基因中不存在与所述 外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量 控制，包括： 利用随机引物对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外源 ERCC-OO13-cDNA，所述外源ERCC-OO13-cDNA包括外源线性ERCC-OO13-cDNA和外源环状 ERCC-OO13-cDNA ； 利用第一引物和第二引物分别对所述外源ERCC-OO13-cDNA进行实时定量PCR扩增， 所述第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于扩增所述外源线性 ERCC-0013-cDNA和所述外源环状ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于扩增所述外源环状 ERCC-OO13-cDNA，通过所述第一引物扩增获得CtI值，通过所述第二引物扩增获得CT2值； 通过CtI值和CT2值以及公式2[Gt2_ &1] X 100%，计算合成的所述外源环状 ERCC-0013-RNA的环化比例，并选用环化比例超过90%的所述外源环状ERCC-0013-RNA。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的线 性 RNA。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述待测序样本的总RNA中，加入所述 混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除未环化成功的所述外源 线性 ERCC-OO13-RNA。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用链霉亲和素磁珠去除被标记上所述 生物素的套索RNA及所述线性RNA。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学分析包括：获得所述外源 线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA的相对比例、以及以所述外源环状 ERCC-0013-RNA为参考分析所述待测序样本中的环状RNA基因表达变化。
【文档编号】C12Q1/68GK104388548SQ201410604748
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】周俊飞, 高利芬, 陈利红, 李丽丽, 彭海, 张继, 方治伟 申请人:江汉大学