一种牛贝诺孢子虫病巢式pcr检测方法
【专利摘要】一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，涉及一种分子生物学检测方法，该方法以样品DNA为模板，利用虫体的核糖体ITS序列引物B1/B2进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，通过设计的一对鉴别贝诺孢子虫的特异性引物B3/B4，进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如果出现393bp的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。本发明的贝病的巢式PCR检测方法，对虫体基因组DNA的检测灵敏度为24.3ag/μL，并且能克服染色镜检和常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、灵敏的贝病的早期诊断的分子生物学方法，对该病的早期检测和有效地预防具有重要的意义。
【专利说明】—种牛贝诺孢子虫病巢式检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子生物学检测方法，特别是涉及一种牛贝诺孢子虫病巢式？(?检测方法。
【背景技术】
[0002]牛贝诺孢子虫病(86811011:10818)是由贝氏贝诺孢子虫切6812011:13 1)6811011:1)寄生于牛眼、皮肤和生殖系统等部位引起的一种原虫病。其包囊寄生于草食动物的皮下、结缔组织、浆膜和呼吸道黏膜等处；主要侵害的部位是眼、皮肤和生殖系统，能引起母牛流产、产奶量下降、公牛精液质量下降，严重时引起死亡，对养牛业危害很大。给养殖业带来了巨大的经济损失。
[0003]牛贝诺孢子虫病分布广泛，最初牛贝诺孢子虫的病例报道常见于南非，以色列等国家，近些年已经蔓延到欧洲、北美洲、非洲、大洋洲、东亚和中东等地区，并有进一步扩散的趋势。其中欧盟的葡萄牙、西班牙、法国、德国和意大利等国家牛贝诺孢子虫的流行区域的范围和流行率不断增加，给养殖业带来了巨大的经济损失。因此，2010年欧盟食品安全委员会⑶?“)将牛贝诺孢子虫病列为重要的新兴疾病，人们逐渐对牛贝诺孢子虫病重视起来。在我国，主要发生在北京、内蒙古自治区、吉林省和黑龙江省，在黑龙江省呈地方性流行，主要分布在西部地区。因此，研究该病的检测方法，对该病的早期快速确诊和及时预防具有十分重要的意义。
[0004]目前，牛贝诺孢子虫病的诊断主要有病原学检查、血清学检查和分子生物学诊断。病原学诊断方法是通过观察包囊内的缓殖子以及血液中的速殖子形态结合临床症状进行诊断；血清学方法主要有间接免疫荧光试验(正八)、酶联免疫吸附试验)和免疫印迹(1606111 8100等方法，但这些方法应用的抗原都是贝诺孢子虫的虫体抗原，不利于大规模生产。牛贝诺孢子虫病分子诊断方法主要是方法，该方法是一种普通的方法，敏感性较低，当感染初期，血液中的速殖子较少时容易引起漏检。巢式？(?方法不但提高了
反应的特异性，同时也提高了反应的敏感性，能检测较低拷贝数的模板。在虫体基因组中，核糖体是一个由不同结构组成的重复单元，拷贝数量高，是设计引物进行？⑶扩增的理想区域。其中核糖体转录间隔区(113)的选择性压力比较小，其进化速率要比转录区的快而且能够区分不同的物种，同时具有种内的相对保守性。因此，很多研究方法都是依据此进行设计。
[0005]本发明通过选取113序列设计特异性引物，运用巢式方法对贝诺孢子虫病进行检测，在国内外尚且没有报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种牛贝诺孢子虫病巢式检测方法，该检测方法具有敏感性高、特异性强的特点，用于贝诺孢子虫病的早期检测，对贝诺孢子虫病的诊断和流行病学调查及防治提供依据，具有十分重要的意义。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种牛贝诺孢子虫病巢式检测方法，所述方法包括以下几个步骤:
步骤0、基因组0嫩提取:采用普通0嫩提取方法提取贝诺孢子虫0嫩；
步骤第一轮扩增:以步骤1)得到的样品0嫩为模板，采用虫体113序列引物刚1/刚2经？⑶扩增得到第一轮？⑶产物；腿序列为:5，-！0^1 I'丁八八丁八織^10八八?:001 I'-3，，刚2 序列为:5，-100 100 601 I'八丁 16^ I'八丁 60-3^ ；
步骤3〕、第二轮扩增:以第一轮扩增产物为模板，设计贝诺孢子虫特异性引物83/84经？⑶扩增得到第二轮？⑶扩增产物；刚3序列为:5’八001 001 0^0 101 601八丁-3，，刚4 序列为:5，-100 101 6X6 1X0 八丁丁八丁丁 0?3，；
步骤？⑶扩增产物检测:取5叱第二轮？⑶扩增产物，加入1叱的6X1021(111181x1打61'，混勻后于1%琼脂糖凝胶中，￡8浓度为5呢/此，100 V电压下电泳30 0111,凝胶成像系统观察并拍照，存在约393如的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。
[0008]所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式检测方法，所述步骤2) 反应体系25叱:10X^1^ 811 打61~ 2.5^1, ^1？ 11x^111-6 (2.5^01 6狀10 2虬，上、下游引物(25^)各
0.5虬，模板0嫩1虬，位I叫(5^/1^1) 0.2虬，加水至25虬。
[0009]所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式？⑶检测方法，所述步骤2)9(?扩增体系:941预变性5111111，941变性1111111，551退火1-11，721延伸1111111，共35个循环，721延伸10111111，41 保存。
[0010]所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式检测方法，所述步骤3) 反应体系25叱:以第一轮？⑶产物1虬为模板，10 X位I叫811打61~ 2.51^，伽1？ 11x^111-6 (2.5^01 6^)2虬，上、下游引物(2511)1)^0.514^^^0^ 1虬，位I'叫(5^/1^1) 0^2虬，加水至25虬。
[0011]所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式？⑶检测方法，所述步骤3)9(?扩增体系:941预变性 5111111，941 变性 1111111,49.81 退火 1111111，721 延伸 3086。，共 35 个循环，721 延伸 10111111，41 保存。
[0012]本发明的优点与效果是:
1、灵敏度高:本发明检测灵敏度为24.3叫/叱，较常规？(?的灵敏度提高了 1000倍以上。
[0013]2、特异性强:本发明针对性的检测贝诺孢子虫，能扩增出大小为393如的单一的特异性条带，不受其他虫体0嫩影响，检测率高。
[0014]3、实用性好:本发明可用于牛贝诺孢子虫病的检测，对该病的早期检测和及时防治提供重要依据，具有十分重大的意义。
[0015]4、操作简单便捷:应用本发明的方法，对牛贝诺孢子虫血液提取0嫩，扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，一般在6小时即可完成，易于推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是贝诺孢子虫常规特异性检测扩增结果；
图2是贝诺孢子虫巢式特异性检测扩增结果；
图3是贝诺孢子虫常规？(?灵敏性扩增结果；
图4是贝诺孢子虫巢式灵敏性扩增结果。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图所示实施例，对本发明作进一步详述。
[0018]本发明方法筛选出的引物及反应参数，扩增所用的引物、扩增片段大小及参数为:
第一轮扩增采用虫体核糖体转录区间隔子(113)序列引物8X1/8吧经扩增得到第一轮产物:
腿序列为:5，-16^ 0^1 丁I'八八I'八織^10八八?:001 I'-3，，
刚2 序列为:5，-100 100 601 1^1 16^ 1^1 60-3^ ；
扩增片段大小:800如
反应参数为:941预变性5111111，941变性1111111，551退火1111111，721延伸1111111，共35个循环，721延伸100111，41保存;
第二轮扩增所用引物为刚3/刚4:
83序列为:5，001 001 0^0 101 601 八丁-3，，
84序列为:5，-100 101 6X6 1X0 八 17 八 17 0?3，；
扩增片段大小:393如
反应参数为:941 预变性 5111111，941 变性 1111111,49.81 退火 1111111，721 延伸 3086(3，共35个循环，721延伸100111，41保存；
本发明样品分析为:第二轮？(?扩增片段大小与预期一致，表明在该样品中检测出牛贝诺孢子虫的113序列，即该牛感染了牛贝诺孢子虫病，反之未感染。
[0019]实施例:
贝诺孢子虫病的巢式检测:
1、样品0嫩提取:
利用0嫩提取试剂盒(”八似卹6611011110 0嫩1(10，提前准备561，701水浴，具体过程如下:
1)取患牛血液200叱加入20叱蛋白酶1(溶液，混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0020]2)加入200叱缓冲液⑶，充分颠倒混匀，701放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0021]3)加入200叱无水乙醇，充分振荡混匀1秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0022]4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱083中(吸附柱放入收集管中)，12 000印111离心30秒，倒掉废液，将吸附柱?:83放入收集管中。
[0023]5)向吸附柱083中加入500叱缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12 000 1-13111离心30秒，倒掉废液，将吸附柱?:83放入收集管中。
[0024]6)向吸附柱?:83中加入700叱漂洗液？1，12 000印111离心30秒，倒掉废液，将吸附柱083放入收集管中。
[0025]7)将吸附柱?:83中加入500虬漂洗液？1，12 000印111离心30秒，倒掉废液。
[0026]8)将吸附柱083放回收集管中12 000印111离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱083置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0027]9)将吸附柱083转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200叱洗脱缓冲液！'2，室温放置2-5分钟，12 000印111离心2分钟，将溶液收集到离心管中。-20° 低温保存备用。
[0028]2、第一轮？⑶扩增:
以提取的虫体0嫩为模板，采用虫体113序列引物8X1/8吧进行第一轮扩增。
[0029]引物序列:腿:5，-16^0^1 I'丁八八丁八織 ^10 八八?:001 I'-3，，刚2:5，-100 100601 I'八丁 16^ I'八丁 60-3 ^ ；
卩⑶反应体系 25叱:10 & I'叫 811 打61~ 2.5)4^，伽了？ 11x1:111-6 (2.5^01 6^0)1)
上、下游引物(2511)1)^0.514^^^0^ 11^1, ^ I'叫(51/1^)0.214^^^^2514^
[0030]？⑶扩增体系:941预变性50111，941变性加丨!!，551退火加化，721延伸1111111,共 35 个循环，72。。延伸 10111111, 4。。保存；
图1是贝诺孢子虫常规？⑶特异性检测扩增结果，其中1为2000恥的0嫩分子量1成虹，1为贝诺孢子虫病原，2-6依次为弓形虫、新孢子虫。巴贝斯虫、锥虫和无浆体的参照病原，7为阴性对照。
[0031]常规？⑶扩增结果显示，只有在泳道1贝诺孢子虫病原处有800恥的特异性条带，泳道2-6和阴性对照处均无扩增条带。
[0032]贝诺孢子虫病的巢式特异性试验:
3、第二轮扩增:以第一轮扩增产物为模板，采用贝诺孢子虫特异性引物刚3/
001 001 0^0 101 601
八丁-3’，刚4:5’ -100 101 6X6 1X0 ^11 ^11 0?3’ ；
？邙反应体系25虬:以第一轮？邙产物1虬为模板，10X^1^ 811打61~ 2.5虬，伽丁？11x^111-6 (2.511111101 )2虬，上、下游引物(25^)各 0.5虬，模板 0嫩 1虬，位I'叫(5^/1^1)
0.2虬，加水至25虬。
[0033]？⑶扩增体系:941预变性50111，941变性加化，49.81退火加化，721延伸3086。，共35个循环，721延伸10111111，41保存；
4、扩增产物检测:
取5虬第二轮扩增产物，加入1虬的6 X 108(11118 811^61-,混匀后于1%琼脂糖凝胶(￡8浓度为5 ^/01)中100 V电压下电泳30 -11,凝胶成像系统观察并拍照，如果存在约393如的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。
[0034]图2是巢式特异性检测扩增结果，其中1为20001^的0嫩分子量1成61~，1为贝诺孢子虫病原，2-6依次为弓形虫、新孢子虫。巴贝斯虫、锥虫和无浆体的参照病原，7为阴性对照。
[0035]巢式？⑶扩增结果显示，只有在泳道1贝诺孢子虫病原处有393恥的特异性条带，泳道2-6和阴性对照处均无扩增条带。
[0036]贝诺孢子虫病的常规灵敏度试验:
将标准浓度为24.3118/此贝诺孢子虫的基因组0嫩10倍倍比稀释为2.43118/叱，243呢/乩，24.3呢/虬，2.43^/1^1, 243^^/^1, 24.2.43^/虬，2438^/^1 和 24.3^/
叱，共10个浓度梯度，第11个泳道是阴性对照。取各浓度的0嫩1叱作为模板，用引物刚1/8^2进行第一次扩增。
[0037]图3是贝诺孢子虫常规？⑶敏感性检测扩增结果，其中1为2000恥的0嫩分子量 1为贝诺孢子虫浓度为24.3118/虬病原，2-11依次为2.43^/)^,2431^/1^,24.3^/
虬，2.43呢/虬，2434/虬，24.2.43^/虬，243^/^, 24.3^/^1 和 0.2438^/^1 的参照病原，12为阴性对照。
[0038]图3结果显示，单独使用8X1/8吧引物进行第一次？⑶扩增，在泳道1-7均能扩增出800如的单一条带，表明病原检测的最低浓度为2434/4。
[0039]贝诺孢子虫病的巢式灵敏度试验:
同贝诺孢子虫病的常规灵敏度试验，将常规测得的浓度为2.431^/叱的第一轮产物的贝诺孢子虫基因组0嫩假设为标准标准浓度，再进行10倍倍比稀释，分别稀释为 2434/14^24.34/14^2.434/14^243218/14^24.3^/14^2.43^/14^0.243218/14^
0.0243^8/1^1和0.00243叫/虬，共10个梯度，第11泳道为阴性对照。取各浓度的0嫩1虬为模板，用引物83/84进行第二轮扩增。
[0040]图4是贝诺孢子虫巢式敏感性检测扩增结果，其中1为2000恥的0嫩分子量1成61~，泳道1-16分别是浓度为2.43^/^1, 2434/虬，24.34/虬，2.43^/虬，243叫/虬，24.2.43^/1^1,0.243^/^1,0.0243^/1^，和 0.002438^/^1 的贝诺孢子虫的病原，11泳道为阴性对照。
[0041]图4结果显示，使用引物83/84进行第二轮？(?扩增，在泳道1-5均能扩增出393如的条带，表明该次检测的病原最低浓度为24.3^/4。与实施例3的结果相比，本发明的巢式检测灵敏度是单独使用引物8附/8吧进行一次扩增检测灵敏度的1000倍。
[0042]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括以下几个步骤: 步骤I)、基因组DNA提取:采用普通DNA提取方法提取贝诺孢子虫DNA ； 步骤2)、第一轮PCR扩增:以步骤I)得到的样品DNA为模板，采用虫体ITS序列引物BN1/BN2 经 PCR 扩增得到第一轮 PCR 产物；BN1 序列为:5，_TGA CAT TTA ATA ACA ATC AACCCT Τ-3，，ΒΝ2 序列为:5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，； 步骤3)、第二轮PCR扩增:以第一轮PCR扩增产物为模板，设计贝诺孢子虫特异性引物B3/B4经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；BN3序列为:5’-CCA CCT CCT CAC TCT GCTAT-3，，BN4 序列为:5，-TCC TCT GTG TTC ATT ATT CC-3，； 步骤4)、PCR扩增产物检测:取5 PL第二轮PCR扩增产物，加入?μ?的6XLoadingBuffer,混勻后于1%琼脂糖凝胶中，EB浓度为5 Pg/mL, 100 V电压下电泳30 min,凝胶成像系统观察并拍照，存在约393bp的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。
2.根据权利要求1所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述步骤 2) PCR 反应体系 25 μ 1-.1QXEx Taq Buffer 2.5μ?, dNTP Mixture (2.5mmol each)2PL，上、下游引物(25mM)各 0.5μ?，模板 DNA ?μ?,Βχ Taq (5U/^L) 0.2μ?，加水至 25μ?。
3.根据权利要求1所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述步骤2)?0?扩增体系:941:预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火Imin，72°C延伸Imin,共35个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
4.根据权利要求1所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3) PCR反应体系25μ?:以第一轮PCR产物WL为模板，10 X位Taq Buffer 2.5μ?, dNTPMixture (2.5mmol each) 2μ?，上、下游引物(25mM)各 0.5μ?，模板 DNA ?μ?, Ex Taq (5U/μυ ο.2μ?，加水至 25μ?。
5.根据权利要求1所述的一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3)?0?扩增体系:941:预变性5min，94°C变性lmin，49.8°C退火Imin，72°C延伸30sec，共35个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
【文档编号】C12Q1/04GK104388550SQ201410605699
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】常巧呈, 张艳, 罗英花, 王文涛, 岳东梅, 那璐, 孙健, 宋利国, 薛瑞, 王云光, 李莉莉, 王春仁 申请人:黑龙江八一农垦大学