鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。
【专利说明】鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检 测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于RT-PCR检测试剂盒【技术领域】，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和鸭源新 城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus, DTMUV)是危害病原。该病主要侵害产蛋鸭和 雏鸭，引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡，导致产蛋鸭高淘汰率，自2010年爆发以来严 重危害养鸭业。鸭源新城疫病毒（Newcaslte Disease Virus，NDV)，同样引起产蛋鸭的产蛋 下降。鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒感染产蛋鸭后，引起相似的症状即产蛋下降，因此迫 切需要建立一种快速敏感的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒检测方法，以便在感染早期就 能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方 法有病毒分离、琼脂扩散试验等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点， 在实际应用中具有一定的局限性。
[0003] 荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现 多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时 间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速 检测。多重荧光PCR采用多对弓I物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是， 建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要 保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检 测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒进 行检测和诊断的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定 量鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒两种病原体。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病 毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4， 它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列。
[0006] 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组 和探针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5 的喊基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的喊基序列。
[0007] 探针A的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ2 ;探针B 的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQl。
[0008] 弓丨物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1 :1 :1 :1 :1 :1。
[0009] 该试剂盒含有以下试剂：
[0010] A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ;
[0011] B液：DTMUV+NDV模板，作为阳性对照；
[0012] C液：ddH20,作为阴性对照。
[0013] A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0. 2 μ mol/L，引物3、引物4、探针B终浓 度均为 0· 2 μ mol/L。
[0014] 针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时进行检测和诊断的有效可 靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得 最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的二重荧光定量 RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
[0015] 1)检测时间短
[0016] 应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR -步完成，仅需约30分钟， 并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3. 5小时来完成扩增 反应，然后还得花1小时进行凝胶电泳来观察结果；
[0017] 2)检测敏感性高且特异性强
[0018] 当鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个 病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检出 及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性 非常高，均能检测到100个拷贝的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒，比常规PCR方法敏感性 高10倍，因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病 机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性（R0X通道）结果图，图中： 1?9分别为I X IOltl?I X IO2拷贝/ μ 1，10空白对照（为DEPC水）。
[0020] 图2是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性（R0X通道）的标准曲线。
[0021] 图3是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的敏感性（FAM通道）结果图，图中： 1?9分别为I X IOltl?I X IO2拷贝/ μ 1，10空白对照（为DEPC水）。
[0022] 图4是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的敏感性（FAM通道）的标准曲线。
[0023] 图5是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的特异性（R0X通道）结果图，图中：1 鸭坦布苏病毒，2鸭坦布苏病毒+鸭源新城疫病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒，5减蛋综 合症病毒，6鸭瘟病毒，7Η9亚型禽流感，8ddH 20。
[0024] 图6是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的特异性（FAM通道）结果图，图中： 其中1鸭源新城疫病毒，2鸭坦布苏病毒+鸭源新城疫病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒， 5减蛋综合症病毒，6鸭瘟病毒，7H9亚型禽流感，8ddH 20。
[0025] 图7是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的批内重复性（R0X通道）结果图，图 中：1_4分别同一批次内四个重复样品，5-7为阴性对照。
[0026] 图8是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的批内重复性（FAM通道）结果图， 图中：1_4分别为同一批次内四个重复样品，5和6空白对照。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
[0028] Lightcycler2. 0荧光定量PCR仪（Roche) ;DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取 试剂盒购自BioDev公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自 Fermengtas 公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit 购自大连宝生物公司；TIANamp 病毒 基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
[0029] 鸭坦布苏病毒记载在"4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定"，中国动物检疫， 2013, 30 (6) : 31-35,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0030] 减蛋综合症病毒记载在"减蛋综合症植物油乳剂苗的研究"，中国预防兽医学报， 2000,（04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0031] 鸭圆环病毒记载在"广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查"，中国畜牧兽 医，2010, 37 (11) :156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0032] 小鹅瘟病毒记载在"小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立"，上海畜牧兽医通 讯，2008,160 (06) :30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0033] 新城疫病毒记载在"新城疫植物油乳剂苗的研究"，中国预防兽医学 报，2000,（04) : 23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
[0034] 鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；
[0035] H9亚型禽流感病毒记载在"多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流 感病毒方法的建立"，中国人兽共患病学报，2006,（09) :858-860,公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得。
[0036] 实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
[0037] 根据GenBank中鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的保守序列，采用Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异 性引物和两条Taqmam探针（表1)。
[0038] 表1为引物和TaqMan探针序列（5' -3'）
[0039]
【权利要求】
1. 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包 括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、 SEQ. ID. No. 4和5的喊基序列。
2. -种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在 于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 3和 6的碱基序列。
3. 根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测 试剂盒，其特征在于：所述探针A的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧光染 料BHQ2 ;所述探针B的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQl。
4. 根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测 试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1 :1 : 1 ： 1 ： 1 ：IO
5. 根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测 试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂： A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B ; B液：DTMUV+NDV模板，作为阳性对照； C液：ddH20,作为阴性对照。
6. 根据权利要求5所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测 试剂盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0. 2 y mol/L，引物3、引 物4、探针B终浓度均为0? 2 ii mol/L。
【文档编号】C12N15/11GK104313186SQ201410606300
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】谢芝勋, 曾婷婷, 谢丽基, 邓显文, 谢志勤, 罗思思, 刘加波, 黄莉, 黄娇玲 申请人:广西壮族自治区兽医研究所