一种磁性载体固定化脂肪酶的制备及其催化制备生物柴油的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种固定化脂肪酶催化制备生物柴油方法，尤其涉及一种葡萄糖酸改性的磁性载体固定化脂肪酶的制备及其催化大豆油制备生物柴油方法，属于生物能源【技术领域】。该工艺采用化学共沉淀法合成出粒径分布均匀、稳定的磁性Fe3O4纳米颗粒，用葡萄糖酸对磁性颗粒表面进行了修饰，再将游离南极假丝酵母脂肪酶化学共价结合至磁性载体表面，得到一种具有磁性的固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶催化大豆油合成生物柴油，甲醇采用分批加入法，反应转化率可达90%以上，反应后酶回收方便，重复使用7次后，酶活性仍能维持在90%以上。
【专利说明】一种磁性载体固定化脂肪酶的制备及其催化制备生物柴油
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化脂肪酶催化制备生物柴油方法，尤其涉及一种葡萄糖酸改性的磁性载体固定化脂肪酶的制备及其催化大豆油制备生物柴油方法，属于生物能源【技术领域】。
【背景技术】
[0002]生物柴油主要是以动植物油为原料，通过酯交换反应制备的长链脂肪酸酯类物质。其具有生物可降解、可再生资源、无毒、废气排放量小等优点，是环境友好型燃料，作为可再生的替代能源已引起了世界范围的广泛关注。目前生物柴油的生产工艺主要有化学法和生物酶法。化学法一般以无机酸或碱作为催化剂，存在工艺复杂、能耗高、醇消耗量大、环境污染等缺点；生物酶法则具有反应条件温和、产物易分离、环保等优点，被认为是有望取代化学法生产生物柴油的绿色工艺。若采用游离脂肪酶作为催化剂，反应结束后，酶的分离、再生、循环使用很困难。若采用固定化脂肪酶，可克服上述游离酶的缺陷，使酶分子在有效地发挥催化作用的同时被保护起来，不易受环境影响，易于从底物和产物中分离，可多次循环使用，从而降低成本，显示良好的应用前景。
[0003]CN102260719A公布了一种固定化脂肪酶催化黄连木油制备生物柴油的方法，以苎麻为载体固定化猪胰脂肪酶，该固定化酶催化黄连木油制备生物柴油，反应后回收重复使用13次，其活性保持率大于80%。CN101717801A公开了一种利用玉米芯固定化脂肪酶制备生物柴油的方法，使用的玉米芯固定化脂肪酶制备生物柴油转化率为63.8%?97.5%。CN101280210A，一种固定化包衣酶制备生物柴油的方法，在催化剂固定化包衣酶的作用下和一定温度下，将低碳醇与动植物油脂混合，加入有机溶剂正己烷和水，搅拌使酯交换反应进行。CN101255348A公开了一种利用固定化脂肪酶一透醇膜生物反应器制备生物柴油的方法，将脂肪酶通过物理吸附固定于中空纤维透醇膜的表面，制备固定化脂肪酶的膜组件，然后组装为酶一膜生物反应器；油脂走膜组件的壳程，低碳醇则走膜组件的管程，在固定化脂肪酶的催化作用下油酯化为生物柴油；利用低碳醇选择性透过中空纤维膜来提供生物柴油制备过程中所需的低碳醇，从而有效避免了由底物引起的酶活抑制作用，能够高效制备生物柴油。CN1818026A，本发明涉及一种固定化脂肪酶法在非水相体系催化醇解动植物油脂生产生物柴油的方法，该生产方法包括海藻酸钠、高岭土、戊二醛、明胶、乳糖组成的共固定剂对脂肪酶的固定化，球形固定化酶以自然状态堆积在填充床酶柱反应器中，在生物柴油作为溶剂的条件下醇解动植物油脂，生产生物柴油。
[0004]可以看出，固定化酶提高了酶的活性，重复利用方便。相关专利采用了多种载体实现酶的负载，并取得了一定效果。负载酶的一个重要指标是表面积大，这样催化效率才高。高的表面积要求催化剂颗粒要小，使用、分离和回收就会有困难。一般酶的负载利用沉积原理，是物理作用，利用的是分子间作用力，这种力相对于化学键小得多，因此容易造成酶从载体脱落。
[0005]发明目的为了提高酶的催化效率和重复利用率，本发明使用葡萄糖酸改性的磁性颗粒作为酶载体，利用磁性可方便地使用、固定、回收催化剂；使用特定的化学反应方法对脂肪酶进行固定化，结合牢固，保持了酶活性，大大提高了酶的催化效率；采用该固定化脂肪酶以植物油和甲醇为底物合成生物柴油，甲醇采用分批加入法，反应转化率高，反应后酶回收方便，重复利用效果好，大大降低生产成本。
[0006]技术方案
本发明采用了如下技术方案。
[0007]I 一种磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:取适当比例亚铁和铁无机盐混和物水溶液，氮气保护下滴加无机碱控制合适PH值，搅拌反应30分钟，水浴条件下晶化2小时，磁场分离出大表面积、稳定的Fe3O4纳米颗粒；水浴搅拌条件下将葡萄糖酸弱碱性水溶液滴加到磁性Fe3O4颗粒胶体中，剧烈搅拌反应数小时，磁场分离出葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒，真空干燥；取葡萄糖酸改性的磁性Fe3O4颗粒载体与1_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液超声分散后加入脂肪酶溶液，超声分散，振荡反应数小时，过滤，磷酸缓冲液洗涤，真空干燥得磁性载体固定化脂肪酶；取适量大豆油、甲醇、溶剂和制备的固定化脂肪酶于恒温振荡器中反应，反应过程中分批加入甲醇。
[0008]2根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:亚铁和铁无机盐为氯化物或硫酸盐，亚铁和铁无机盐摩尔比为1:1.5?3。
[0009]3根据权利要求1和2所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:铁和亚铁无机盐混和物水溶液反应时，滴加的无机碱为氨水或氢氧化钠水溶液，所控PH值为l(Tll。
[0010]4根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:大表面积、稳定的Fe3O4纳米颗粒的制备通过反应温度控制，搅拌下反应温度为30^600C，水浴晶化温度为7(T90°C。
[0011]5根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:葡萄糖酸弱碱性水溶液中氢氧化钠浓度为1.25mol/L，葡萄糖酸弱碱性水溶液浓度为25mg/mL，葡萄糖酸改性磁性Fe3O4颗粒反应的水浴温度为25?40°C，真空干燥温度为80。。。
[0012]6根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒载体与1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液超声分散前均用pH=8.0的NaH2PO4-Na2HPO4磷酸缓冲液配制，碳化二亚胺溶液浓度为12.5 mg/mL0
[0013]7根据权利要求1和6所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:所加入脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶，酶用量:载体量=1:1 (质量比)。
[0014]8根据权利要求1、6和7所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:脂肪酶固定化反应的水浴温度为2(T30°C，反应时间为2(Γ30小时。
[0015]9根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:溶剂为正己烷与水的混合物，醇油质量比为3:1，固定化脂肪酶占油的质量分数为20%，水体积为反应介质体积的15?25%。
[0016]10根据权利要求1和9所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:催化制备生物柴油的反应温度为40°C，反应时间为1(Γ15小时。
[0017]本发明的有益效果。
[0018]I制得的固定化酶在热稳定性，耐酸碱能力、重复利用率及贮藏稳定性等方面比游离酶有了很大程度提高，尤其是反应键合，酶与载体结合牢固。当温度升高至55°C时，固定化酶活性保持在75%左右，而游离酶活性仅保留10% ;使用葡萄糖酸改性的磁性颗粒作载体固定化酶反复使用7次后，活性仍然能维持90%以上；在储存30天后，以葡萄糖酸改性的磁性颗粒作载体的固定化酶活性与游离酶对比有明显优势，分别为85%和20%。
[0019]2使用葡萄糖酸改性的磁性颗粒固定化酶催化生产生物柴油，甲醇用量少，后处理简单，转化率高。甲醇对酶蛋白具有抑制作用，其分批加入减小了甲醇在反应体系中的浓度，酶蛋白可以更好地发挥催化作用，同时有利于反应平衡向正反应方向进行；溶剂的加入增大了催化剂和底物间的传质速度，提高了催化效率；反应后固定化酶易于分离，重复使用7次后，转化率仍达90%以上，大大降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0021]I化学共沉淀法合成四氧化三铁纳米颗粒
将摩尔比为1:2的硫酸亚铁和氯化铁固体溶解在适量的的稀盐酸中。待铁离子溶液呈透明状后将其转入四颈圆底烧瓶中，在氮气保护、剧烈搅拌下，连续滴加1.5 mo I/L NaOH溶液至pH=10，室温下反应30分钟后，水浴温度升至80°C水浴晶化2小时。磁铁分离磁性颗粒，去离子水反复洗涤至中性后，得到Fe3O4纳米颗粒。
[0022]2磁性四氧化三铁纳米颗粒的表面改性
磁性Fe3O4纳米颗粒通过超声，均匀分散到20.0 mL去离子水中，将10.0 mL由0.5 g氢氧化钠和0.5 g葡萄糖酸配制的水溶液逐滴加入磁性颗粒胶体中，在30°C水浴锅中，剧烈搅拌反应4小时。用磁铁分离改性的Fe3O4纳米颗粒。去离子水反复洗涤，80°C真空干燥，密封保存备用。
[0023]3葡萄糖酸改性的磁性颗粒作载体制备固定化脂肪酶
取5.0 mg载体，加入到2.0mL pH=8.0磷酸缓冲溶液，加入1.0mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶液(12.5 mg/mL磷酸缓冲液)，超声10分钟，再加入2.0 mL
2.5mg/mL南极假丝酵母脂肪酶溶液，超声30分钟，25°C，水浴摇床振荡24小时，过滤，磷酸缓冲液洗涤三次，40°C真空干燥24小时，得到固定化脂肪酶。
[0024]4固定化脂肪酶催化制备生物柴油
具塞锥形瓶中加入2.0g大豆油、2.0g甲醇、2.0mL正己烧、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴摇床振荡反应12小时，反应过程中分两次分别加入2.0g甲醇，转化率为92%。
[0025]5固定化脂肪酶催化制备生物柴油
具塞锥形瓶中加入2.0g大豆油、2.0g甲醇、3.0mL正己烧、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴摇床振荡反应15小时，反应过程中分两次分别加入2.0g甲醇，转化率为89%。
[0026]6固定化脂肪酶催化制备生物柴油
具塞锥形瓶中加入2.0g大豆油、3.0g甲醇、3.0mL正己烧、ImL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴摇床振荡反应12小时，反应过程中加入3.0g甲醇，转化率为77%。
[0027]7固定化脂肪酶催化制备生物柴油具塞锥形瓶中加入2.0g大豆油、1.0g甲醇、2.0mL正己烧、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴摇床振荡反应12小时，反应过程中分两次分别加入2.5g甲醇，转化率为85%。
[0028]8固定化脂肪酶催化制备生物柴油具塞锥形瓶中加入2.0g大豆油、1.5g甲醇、4.0mL正己烧、1.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴摇床振荡反应12小时，反应过程中分三次分别加入1.5g甲醇，转化率为73%。
【权利要求】
1.一种磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:取适当比例亚铁和铁无机盐混和物水溶液，氮气保护下滴加无机碱控制合适PH值，搅拌反应30分钟，水浴条件下晶化2小时，磁场分离出大表面积、稳定的Fe3O4纳米颗粒；水浴搅拌条件下将葡萄糖酸弱碱性水溶液滴加到磁性Fe3O4颗粒胶体中，剧烈搅拌反应数小时，磁场分离出葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒，真空干燥；取葡萄糖酸改性的磁性Fe3O4颗粒载体与1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液超声分散后加入脂肪酶溶液，超声分散，振荡反应数小时，过滤，磷酸缓冲液洗涤，真空干燥得磁性载体固定化脂肪酶；取适量大豆油、甲醇、溶剂和制备的固定化脂肪酶于恒温振荡器中反应，反应过程中分批加入甲醇。
2.根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:亚铁和铁无机盐为氯化物或硫酸盐，亚铁和铁无机盐摩尔比为1:1.5?3。
3.根据权利要求1和2所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:铁和亚铁无机盐混和物水溶液反应时，滴加的无机碱为氨水或氢氧化钠水溶液，所控pH值为10?11。
4.根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:大表面积、稳定的Fe3O4纳米颗粒的制备通过反应温度控制，搅拌下反应温度为3(T60°C，水浴晶化温度为7(T90°C。
5.根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:葡萄糖酸弱碱性水溶液中氢氧化钠浓度为1.25mol/L，葡萄糖酸弱碱性水溶液浓度为25mg/mL,葡萄糖酸改性磁性Fe3O4颗粒反应的水浴温度为25?40°C，真空干燥温度为80°C。
6.根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒载体与1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液超声分散前均用PH=8.0的NaH2PO4-Na2HPO4磷酸缓冲液配制，碳化二亚胺溶液浓度为12.5mg/mL。
7.根据权利要求1和6所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:所加入脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶，酶用量:载体量=1:1 (质量比)。
8.根据权利要求1、6和7所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:脂肪酶固定化反应的水浴温度为2(T30°C，反应时间为2(Γ30小时。
9.根据权利要求1所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:溶剂为正己烷与水的混合物，醇油质量比为3:1，固定化脂肪酶占油的质量分数为20%，水体积为反应介质体积的15?25%。
10.根据权利要求1和9所述的磁性载体固定化脂肪酶的制备及催化制备生物柴油，其特征是:催化制备生物柴油的反应温度为40°C，反应时间为1(Γ15小时。
【文档编号】C12N11/14GK104404023SQ201410614900
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】崔玉, 隋颖, 孙国新 申请人:济南大学