环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用。引物组合物，所述的引物组合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP，SEQ ID NO.5所示的环引物LF，以及SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。所述的引物组合物可在制备大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测试剂盒中应用。本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便，能较好满足目前对大豆茎褐腐病菌的快速检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
【专利说明】环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组 合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大豆莖褐腐病菌（Phialophoragregataf.sp.sojae，以下简称PGS)侵染大豆植 株引起大豆茎褐腐病。该病害于1942年首次在美国的伊利诺斯州被发现，后在北美和加拿 大大豆种植地区多次被报道，让美国等地大豆生产蒙受了巨大的损失，产量损失可达30%， 最高66%。PGS被列为欧洲和地中海植物保护组织（EPP0)A1类检疫性有害生物，也是我国 植物检疫性有害真菌之一。目前，PGS主要发生地在巴西、美国中西部和东南部各州、加拿 大、阿根廷、埃及、墨西哥、前南斯拉夫、日本等地，其中在美国和加拿大中北部地区发生尤 为严重，给当地的大豆生产造成了极大威胁。PGS的危害症状主要是大豆的茎部的维管束 和髓部变成褐色，随着病菌进一步扩展，整个茎部成为褐色，并在大豆生长后期引起叶片部 分变色，叶脉坏死和斑点，但是也有些不会发生明显褐变症状，从而使鉴定变得很困难。大 豆茎褐腐根据危害症状分为落叶型（A型）和非落叶型（B型），发病初期的症状与镰孢菌 引起的大豆猝死综合症的症状易混淆[8 - 10]。大豆茎褐腐病是一种土传维管束类病害， 大豆出苗阶段可侵染大豆根系，而在病残体中产生的分生孢子是主要的初侵染源，由于PGS 可存活于大豆残体及土壤中3至5年，随着大豆贸易近年来的持续增加，使PGS通过贸易传 入我国的风险大大增加，所以日前急需一种可以快速，准确检测PGS的方法。
[0003] 随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测大豆 茎褐腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6?8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR 仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。
[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本 荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等 优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异 性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围60min内，能 大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很 强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要 求，检测成本降低，所需时间短。
[0005] 此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染 的一个主要来源；而且溴化乙锭（EB)有巨毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害；长期观察 紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行， 在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝）作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标 准即可，达到快速检测的目的。
[0006] 靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体 基因转录间隔区（Internaltranscribedspace,ITS)，它首先由Gonzalea在1990年提出， 后逐步发展起来成为分子标记，其优点在于：具有高拷贝数；同时包含保守与变异序列；能 根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的ITS总的说来 是相对保守的，但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较，而且其多拷贝数使鉴别性 的扩增更加灵敏。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是解决现有技术中大豆茎褐腐病菌的生物学检测方法所需周期长、 费时费力、PCR检测技术需要昂贵的热循环仪器、检测特异性偏低（如假阳性）、耗时偏长且 操作较繁琐（扩增结果需经电泳后才可判别）等问题，而提供的大豆茎褐腐病菌新的分子 检测方法及使用的引物组合物，对大豆茎褐腐病菌进行LAMP检测，检测周期短（仅需lh)、 准确性高、灵敏性高、可用肉眼观察检测结果。
[0008] 一种用于环介导等温扩增检测大豆莖褐腐病菌（Phialophoragregataf.sp. sojae)的引物组合物，其特征在于由SEQIDNO. 1所示的正向外引物F3,SEQIDNO. 2所 示的反向外引物B3，SEQIDNO. 3所示的正向内引物FIP，SEQIDNO. 4所示的反向内引物 BIP，SEQIDN0. 5所示的环引物LF，以及SEQIDN0. 6所示的环引物LB组成。
[0009]表1
[0010]
【权利要求】
1?一种用于环介导等温扩增检测大豆莖褐腐病菌（Phialophora gregata f.sp. sojae)的引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO. 1所示的正向外引物F3, SEQ ID NO. 2所 示的反向外引物B3，SEQ ID NO. 3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO. 4所示的反向内引物 BIP，SEQ ID NO. 5所示的环引物LF，以及SEQ ID NO. 6所示的环引物LB组成。
2. 权利要求1所述的引物组合物在制备大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测试剂盒 中的应用。
3. -种检测大豆茎褐腐病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于包含权利要求1所 述的引物组合物。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中权利要求1所述的引 物组合物浓度为：1. 6 ii M正向内引物FIP、1. 6 ii M反向内引物BIP、0. 2 ii M正向外引物F3、 0. 2 ii M反向外引物B3、环引物LB和LF各0. 8 ii M。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括1.4mM dNTPs、 0.8M pH8.8 的 Tris-HCl、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM 4%Triton X-100、8mM MgS04、 0? 192mM 轻基漠酌?蓝、8U ? u L 1 Bst DNA polymerase。
6. -种检测大豆茎褐腐病菌的方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物组合物对 待见样品的DNA进行LAMP扩增，在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘 酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆茎褐腐病菌；紫色表 示检测结果为阴性，不存在大豆茎褐腐病菌。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于LAMP扩增的反应程序为：64°C，60min。
【文档编号】C12N15/11GK104328189SQ201410617973
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】郑小波, 吴旭东 申请人:南京农业大学