一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法
【专利摘要】一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，该方法以HepG2细胞重悬于含10％小牛血清的DMEM培养基中并接种培养瓶中，待细胞完全贴壁后用无血清培基洗涤，并更换无血清的DMEM培养液同步化6h，再行更换含5％小牛血清的培养基并加入0.5～1μmol/L胰岛素诱导72h即可。本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，耐药肝癌HepG2细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性。实验证明，通过本发明建立的耐药肝癌HepG2细胞模型具有稳定72小时以上的胰岛素抵抗性。
【专利说明】一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，具体涉及一种同时具有高自噬活性和胰岛素抵抗性的耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)就是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，即靶组织对胰岛素反应的敏感性下降，由此，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。IR是II糖尿病(T2DM)发病的重要机制之一，改善IR是T2DM的基础研究及药物开发的重点。肝脏是胰岛素作用的靶组织之一，是胰岛素抵抗发生的主要部位。胰岛素敏感性降低可导致肝脏葡萄糖异生和葡萄糖输出增加与餐后高胰岛素血症，高胰岛素水平能进一步加重胰岛素抵抗程度，并促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，而胰岛素抵抗更是与包括肝癌等多种肿瘤的发生、进展、转移以及预后不良密切相关，还可促使肿瘤细胞对常规抗癌药物产生抗性，降低肿瘤治疗效果，产生肿瘤多药耐药(MDR)的作用。另外胰岛素抵抗的发生可以通过增加机体氧化应激水平而诱导自噬的发生。自噬是由内质网来源的双层膜结构包裹细胞质中的变性蛋白和受损细胞器形成自噬泡，并携带进入溶酶体内进行降解和加工的过程，其在肿瘤细胞发生发展中具有复杂的作用，因而建立高自噬活性的胰岛素抵抗肝癌细胞模型，便于观察胰岛素抵抗与自噬的关系，了解在肝癌中二者作用消长对于化疗药物敏感性影响及其作用机制，特别是方便于筛选与肝癌耐药性相关的指标、选取抵抗肝癌耐药的高效化疗药物具有重要价值。
[0003]HepG2细胞源于人肝胚胎瘤细胞，保留了肝细胞许多特征的同时也具有肿瘤细胞的特性，其表达高亲和力的胰岛素受体，发挥葡萄糖摄取、糖原合成酶的活性，脂类生成及RNA的合成等作用，同时也具有无限增殖能力和一定的化疗药物耐受性。目前，在胰岛素抵抗和自噬的研究中，尤其研究胰岛素抵抗与自噬机制的联系、化疗药物的筛选及作用靶点、探索肿瘤耐药性早期诊断靶点方面，迫切需要一种同时兼备胰岛素抵抗性、高自噬性，同时又是肿瘤的细胞模型。近年来研究人员已成功复制了多种胰岛素抵抗细胞模型，大多数模型的诱导困难、耗时长且不具备较长时间的稳定性，这些模型对于在较长时间对胰岛素抵抗及其耐药机制的观察有很大程度的局限性。另外，迄今还未有报道建立同时具备胰岛素抵抗性和高自噬活性的耐药肿瘤细胞模型。因此，建立一种简单、稳定、经济，同时具备胰岛素抵抗及高自噬活性的耐药细胞模型显得尤为重要。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，提供一种简单、稳定、经济、典型的耐药肝癌！fepG2细胞模型的构建方法，该细胞模型同时具有高自噬活性和胰岛素抵抗性。
[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，包括以下步骤:
(1)预处理细胞:将常规培养的肝癌HepG2细胞接种于含10% DMEM培养基中在37°C，5% C02培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用；
(2)建立细胞模型:先用无血清培基洗涤步骤(1)中备用的肝癌Η印G2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5?1 μ mol/L胰岛素，置于37°C，5% C02培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37°C孵育15min ;再用0.0lmol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，即成。
[0006]进一步，步骤(1)中，从常规培养的肝癌Η印G2细胞中选取生长良好并处于对数生长期肝癌ifepG2细胞，接种于含10% DMEM培养基中在37°C，5% C02培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用。
[0007]进一步，步骤(2)中，先用无血清培基洗涤步骤(1)中备用的肝癌Η印G2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5 μ mol/L胰岛素，置于37°C，5% C02培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37°C孵育15min ;再用0.0lmol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，即成。
[0008]本发明之构建方法具有操作简单，成本低的特点，耐药肝癌HepG2细胞模型稳定性高、自噬活性高，并具有高自噬活性导致的化疗药物耐受性，有助于在体外研究:(1)肝癌细胞耐药性的早期诊断试剂盒；(2)制备和筛选有效治疗肝癌的化疗药物；(3)可用于筛选改善肝癌自噬活性的药物以有效改善肝癌细胞的耐药状态。实验证明，通过本发明建立的耐药肝癌HepG2细胞模型具有稳定72小时以上的胰岛素抵抗性。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1本发明建立的细胞模型在建立72小时后葡萄糖消耗量和糖原含量的检测。
[0010]图2本发明建立的细胞模型的胰岛素受体的mRNA和蛋白表达的检测。
[0011]图3本发明建立的细胞模型的葡萄糖转运蛋白2的mRNA和蛋白表达的检测。
[0012]图4本发明建立的细胞模型经胰岛素增敏剂(PH)处理后葡萄糖消耗量的检测。
[0013]图5本发明建立的细胞模型的自噬标志蛋白Beclin-1、LC3I/II及自噬底物P62的自噬活性的检测。
[0014]图6本发明建立的细胞模型的自噬泡水平的形态学检测。
[0015]图7本发明建立的细胞模型的耐药性检测。
[0016]图8本发明建立的细胞模型经调节自噬活性后对耐药性影响。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0018]实施例1
(1)构建胰岛素抵抗肝癌Η印G2细胞模型:选取常规培养的肝癌Η印G2细胞中生长良好并处于对数生长期肝癌ifepG2细胞，接种于含10% DMEM培养基(美国Hyclone公司)中在37°C，5% C02培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后，用无血清DMEM洗涤后，更换无血清的DMEM培养液同步化6h，加入0.5 μ mol/L胰岛素并置于37°C，5% C02培养箱中孵育72h，弃培养上清液后，接着用0.01mol/L PBS洗涤，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液(用HC1调节PH为6.0)37°C孵育15min ;再用0.0lmol/L PBS洗涤后，即建立了胰岛素抵抗肝癌Η印G2细胞模型。
(2)检测模型的胰岛素抗性:将建立的胰岛素抵抗肝癌Η印G2细胞模型继续在无胰岛素的正常培养环境中培养72小时后，检测葡萄糖消耗量以及细胞的糖原染色发现，细胞模型在建立后72小时葡萄糖消耗量且糖原含量依然下降明显(图1)。另外用RT-PCR、流式细胞术分别检测胰岛素受体(图2)和葡萄糖转运蛋白2(图3)的mRNA和蛋白表达显示均明显下调，说明该细胞模型具有稳定72小时以上的胰岛素抵抗性。
(3)验证胰岛素抵抗性:用10mmol/L的胰岛素增敏剂盐酸吡格列酮(PH)作用建立的胰岛素抵抗肝癌HepG2细胞模型24h后逆转胰岛素抵抗性(图4)，即胰岛素增敏剂处理后模型细胞的葡萄糖消耗量明显升高，接近于正常细胞水平，从另一角度说明该模型细胞发生了胰岛素抵抗。
(4)检测模型细胞的自噬活性:由于在巨自噬发生过程中自噬正调节蛋白Beclin-Ι表达上调，伴有巨自噬标志物LC3的胞浆型LC3-1向自噬体型LC3-1I转化，并且自噬底物P62有所降低。因而本研究用蛋白印迹法检测胰岛素抵抗肝癌HepG2细胞模型的Beclin-1、LC3II/LC3I及自噬底物P62发现(图5)，与亲本细胞相比，模型细胞的自噬活性增高，伴有自噬底物水平的下降；另外用透射电子显微镜以及自噬泡的特异染色MDC染色法在荧光显微镜下检测细胞的自噬泡数量，显示模型细胞自噬泡数量明显增多(图6)。上述检测均说明该模型细胞自噬水平升高。
(5)检测模型细胞耐药性:将建立的胰岛素抵抗肝癌HepG2细胞模型用顺钼(DDP)16mg/L、5-氟尿嘧啶(5-FU) 250mg/L、长春新碱(VCR) 60mg/L、丝裂霉素(MMC)2mg/L 处理48h，凋亡率较其亲本细胞明显降低，说明该模型细胞具有高自噬活性可能与其对多种化疗药物包括DDP、5-FU、VCR、MMC的耐受性发生有关(图7)。
(6)调节自噬活性后对耐药性影响:通过自噬抑制剂2mmol/L的3-MA预处理建立的胰岛素抵抗肝癌HepG2细胞模型及其亲本细胞4h降低自噬活性，然后用16mg/L的化疗药物顺钼处理48小时后发现两组细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显增高。说明该细胞的化疗药物耐受性与自噬水平增高密切相关，降低模型细胞的高自噬活性可以明显降低化疗药物耐受性(图8)。
【权利要求】
1.一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)预处理细胞:将常规培养的肝癌HepG2细胞接种于含10%DMEM培养基中在37°C，5% CO2培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用； (2)建立细胞模型:先用无血清培基洗涤步骤(I)中备用的肝癌H印G2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5?lymol/L胰岛素，置于37°C，5% CO2培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.0lmol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤I?2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37°C孵育10?15min ;再用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2?3次，即成。
2.根据权利要求1所述的耐药肝癌H印G2细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(I)中，从常规培养的肝癌HepG2细胞中选取生长良好并处于对数生长期肝癌HepG2细胞，接种于含10% DMEM培养基中在37°C，5% CO2培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用。
3.根据权利要求1或2所述的耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，先用无血清培基洗涤步骤(I)中备用的肝癌H印G2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5 μ mo I/L胰岛素，置于37°C，5% CO2培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37°C孵育15min ;再用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，即成。
【文档编号】C12N5/09GK104357397SQ201410618018
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】李林静, 程燕, 李光迪, 魏虎来 申请人:兰州大学