腈水合酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种腈水合酶及其编码基因和应用，该腈水合酶由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明从产酸克雷伯菌KCTC 1686中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。
【专利说明】腈水合酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种腈水合酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 腈是一类重要的化合物，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生 物的合成，在有机合成中占有及其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转 化法，与化学水解法相比生物转化法具有条件温和、环境污染小、并能实现化学、区域和对 映体选择性等优点。生物转化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中腈水合酶可 以催化腈水合生成酰胺，酰胺酶进一步将酰胺催化水解生成羧酸化合物，而腈水解酶可以 直接催化腈生成酰胺化合物。
[0003] 产腈水合酶微生物的分布是相当广泛的，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡 氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺的工业化生产中， 如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D ;专利号 ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1 ;专利号为ZL86100062的专利公开了 一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291. 4的专利公开了一种野 生嗜热假诺卡氏菌JCM3095 ;专利号为ZL03115536. 7的专利公开了一种野生丙酸棒杆菌。
[0004] 目前，利用微生物法生产丙烯酰胺、烟酰胺的方法主要从菌株的筛选和驯化以及 生产工艺的建立和改造等方面开展工作。但是，其中普遍存在野生菌种的酶活稳定性差、对 底物和产物的耐受性不高、产品质量不够稳定等问题，同时在野生菌株中除腈水合酶外，还 存在酰胺酶和腈水解酶，其可以造成副产物烟酸和丙烯酸的生成，从而严重影响烟酰胺和 丙烯酰胺的产量和质量，同时增加分离纯化的难度和生产成本。
[0005] 随着生物技术的迅速发展，人们认识到用基因工程技术手段来构造具有腈水合酶 活性的基因工程菌株可以用来解决上述的难题。用基因工程菌来表达腈水合酶有许多野生 菌所不具有的优点，如可以单独克隆表达腈水合酶，阻断催化反应过程中副反应的发生，不 会使酰胺在产生的同时又有部分被降解，从而提高产品的产量和质量；另外基因工程菌的 适应性强、发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产。当前，重组腈水合酶的研究 已经引起人们广泛的重视，经过众多科研工作者的多年努力也取得了相当多的成就，但是 还存在着诸多问题，如酶的表达水平低、热稳定性不高、对底物和产物的耐受性差，这严重 制约了腈水合酶的工业化应用。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种高表达量、高活性且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。
[0007] 一种腈水合酶，由a亚基和0亚基组成，所述a亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，0亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。该腈水合酶的命名为NHaseK。
[0008] 本发明还提供了一种编码所述的腈水合酶的基因。
[0009] 优选的，所述的基因包含喊基序列如SEQIDNO. 1所不的编码a亚基的基因 和如SEQ ID N0.2所示的编码0亚基的基因。该碱基序列来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686 (Klebsiella oxytoca KCTC 1686)，由 1278 个碱基组成。自 5' 端第 1 位到 609 位碱 基编码腈水合酶a亚基；自5'端第625位到1278位碱基编码腈水合酶3亚基。进一步， 碱基序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0010] 所述的基因还包含编码腈水合酶激活子的碱基序列。所述腈水合酶激活子的碱 基序列如SEQ ID N0. 3所示。为提高表达活性，所述基因经过修饰后连接有激活子的基因 (SEQ ID N0. 3)。进一步地，碱基序列如SEQ ID N0. 8所示。
[0011] 本发明还公开了一种腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0012] 本发明还公开了一种任一所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
[0013] 本发明又公开了一种所述的腈水合酶在制备酰胺化合物中的应用。
[0014] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 5、SEQ ID N0. 6所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围 之列。
[0015] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3所 示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均可实现本发明目的，属于 本发明保护范围之列。
[0016] 本发明提供了一种包含所述腈水合酶基因的重组载体和转化子。
[0017] 本发明还提供了一种所述重组载体和转化子转化得到的基因工程菌。
[0018] 本发明又提供了一种所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。
[0019] 所述的腈化合物为式（I)和（II)所示腈化合物生成对应酰胺中的应用：
[0020]
【权利要求】
1. 一种腈水合酶，由a亚基和0亚基组成，其特征在于，所述a亚基的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 4所示，0亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2. -种编码权利要求1所述的腈水合酶的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，包含碱基序列如SEQ ID NO. 1所示的编码 a亚基的序列和如SEQ ID NO. 2所示的编码0亚基的序列。
4. 如权利要求3所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO. 7所示。
5. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，还包含编码腈水合酶激活子的序列。
6. 如权利要求5所述的基因，其特征在于，所述腈水合酶激活子的碱基序列如SEQ ID NO. 3所示。
7. 如权利要求6所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO. 8所示。
8. -种腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 一种包含权利要求2?7任一所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
10. 如权利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。
【文档编号】C12N15/60GK104450657SQ201410621651
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】杨立荣, 郭法谋, 王丽燕, 吴坚平, 徐刚 申请人:浙江大学