转基因苜蓿草j101品系特异性定性pcr检测用引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测用引物及检测方法。本发明针对针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J101，根据其基因组DNA序列5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区，首次设计和提供一对特异性引物，并成功建立定性PCR检测体系。结果表明，本发明定性PCR检测方法特异性良好，检测的最低DNA浓度为80pg，相当于50拷贝的基因组DNA；适合于J101品系快速、稳定的定性检测。
【专利说明】转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测用引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性的定性PCR检测用引物及检测方法。
【背景技术】
[0002]目前我国存栏数为1500万头奶牛，对优质饲草需求最非常大。转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。为保障消费者的知情权，转基因产品标识制度在30多个国家和地区应用。中国目前实施无阀值的强制性标识制度。
[0003]对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，后者均以PCR为基础的检测技术，PCR技术具高的灵敏度、特异性和稳定性，检测周期短，成本较低。能过普通凝胶电泳观察条带的有无判定扩增产物的有无，通过电泳条带的浓度可以分析检测方法的灵敏度。一方面中国目前实施无阀值的强制性标识制度，可采用普通定性PCR满足对转基因检测的需求，另一方对普通定性PCR对操作者技术水平要求较低，仅需价格低廉的简单PCR仪即可进行，适用于基层实验推广应用。
[0004]根据扩增目标片段位置的不同，基于核酸基础上的PCR检测又可以分为4种检测策略:1)筛查法:对转基因产品中的启动子、终止子等通用基因进行筛查；2)基因特异性检测:对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3)构建特异性检测:对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4)品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。
[0005]品系特异性检测方法是基于外源插入片段和宿主基因接合区的边界序列建立特异性的检测方法。品系性特异性PCR检测方法可以对转基因产品品系进行判定，被认为是最适合转基因标识的检测判定方法。zimmmermanm等首次使用inverse PCR策略获得Btll的接合区序列并建立品系特异性检测方法。
[0006]转基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前我国尚批准其进口。还未获得我国转基因生物安全证书，目前未见到有该作物品系特异性定性PCR检测方法相关文献。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草尚无品系特异性检测方法、不能准确的对转基因苜蓿草的品系进行识别，无法对转基因产品进行标识的技术不足，提供一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测用引物，其具有较高特异性和灵敏度及良好的稳定性，基于所述引物，可成功建立转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方法，实现对转基因苜蓿草JlOl品系进行定性检测。
[0008]本发明要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草JlOl品系进行定性检测的方法。
[0009]本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现:
本发明通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列生物学信息的分析，设计得到一对特异性的引物，以及探针。并确定了精确地检测条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草JlOl品系定性PCR检测方法。
[0010]具体地，提供一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测用引物J101-1和J101-2，其序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’，
SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’。
[0011]同时提供一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方法，包括以步骤:
51.提取DNA作为反应的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2进行定性PCR检测；
其中，S2所述定性PCR检测的反应体系为25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各为 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0012]S2所述定性PCR检测的反应程序为:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30个循环；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0013]本发明采用以下方法验证本发明方法的特异性、灵敏度等:
采用引物J101-1和J101-2对7种常见作物进行定性PCR检测，测试检测体系特异性。
[0014]采用引物J101-1和J101-2对不同浓度的JlOl基因组DNA进行定性PCR检测，测试检测体系灵敏度。
[0015]上述定性PCR检测的反应体系为25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和J101-2 引物分别为 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0016]上述定性PCR检测的反应程序为:98°C 10s, 60°C 30s，72°C 30s, 30个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0017]本发明可以很好地应用于鉴别转基因苜蓿草JlOl品系与其他作物，尤其优选应用于转基因苜蓿草J1i品系与转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆转基因大豆GTS40-3-2、非转基因大叶苜蓿等作物的鉴别检测。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，而后者主要采用PCR技术为基础的检测体系，因为操作简便、稳定性好以及易于推广等优点被广泛应用。根据扩增目标片段位置的不同，基于核酸基础上的PCR检测又可以分为4种检测策略，即筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系(转化事件)特异性检测(徐茂军，2001)，其中品系特异性检测由于可以鉴定出具体的转基因作物品系，因此是特异性最高的检测方法。但由于进境农作物特别是含多种品系的作用，有的只有一部分品系允许进口，另一些可能尚未曾颁发证书，采用筛选检测、基因特异检测、构建特异性检测均无法区分具体的品系，无法对进境产品的转基因成份进行标识。因此目前是采用启动子、终止子或EPSPS结构特异性基因或其组合的筛查检测策略，这只能鉴定苜蓿草是否为转基因，但是不能准确的检测其具体的转基因苜蓿草品系，出入境检验监管部门无法对同一作物具多个转基因品系的转基因作物进行标识管理。公众也无法具体知道其转基因的具体情况。此外，采用多个基因联合筛查的方式会使人力物力大量增加。
[0019]本发明首次设计和提供了一对特异性引物，基于所述引物，本发明成功建立了JlOl品系特异性定性PCR检测方法。本发明基于外源插入片段FMV35S启动子和转基因苜蓿JlOl基因组DNA的5’端旁邻序列建立了转基因苜蓿草JlOl品系特异性(event-specific)定性PCR方法，可以通过成功地扩增可特异性的鉴别区分目前尚未批准的转基因苜蓿草JlOl品系，满足对转基因产品的阀值标识需求，对我国进境转基因苜蓿JlOl的监管和标识提供有力的技术支撑。
[0020]本发明检测方法操作简单、检测结果准确、重复性好。通过对苜蓿草JlOl等农作物进行的特异性试验表明，本发明建立的定性PCR检测方法仅对苜蓿草JlOl品系的检测结果为阳性；大量实验结果表明，定性PCR方法特异性良好，检测的最低DNA浓度为80pg，相当于50拷贝的基因组DNA，能够快速、准确、稳定的用于JlOl品系定性和定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是转基因苜蓿JlOl品系外源插入片段示意图。A为扩增区域。
[0022]图2是JlOl品系特异性定性PCR特异性试验结果，其中7为J101，1-6为6种非JlOl作物。
[0023]图3是JlOl品系特异性定性PCR灵敏度试验结果，其中，1-6分别为100ng、16ng、1.6ng、0.16ng、0.08ng 和 0.016ng 的 JlOl 基因组 DNA 模板。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
[0025]实施例1:建立JlOl品系特异性定性PCR检测体系设计引物:
本发明通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列生物学信息的分析，设计得到一对特异性的引物，以及探针。并确定了精确地检测条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草JlOl品系定性PCR检测方法。
[0026]具体地，提供一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测用引物J101-1和J101-2，其序列分别如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’。
[0027]SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’
所述弓I物可采用本领域常规方法合成。本实施例应用的弓I物委托宝生物合成。
[0028]本发明实施例所述实时荧光PCR检测使用的仪器为B1RAD S1000。
[0029]本实施例基于上述引物，提供一种JlOl品系特异性定性PCRR检测方法，包括以下步骤:
51.提取DNA作为反应的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2进行定性PCR检测；
其中，S2所述定性PCR检测的反应体系为25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各为 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0030]S2所述定性PCR检测的反应程序为:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30个循环；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0031]其中，SI提取DNA具体方法为:称取100 mg左右研磨成干粉的样品，使用天根植物基因组DNA提取试剂盒并按照其操作说明书提取基因组DNA。提取的基因组DNA用微量分光光度计nanOdrOp2000c测定浓度。提取的DNA溶液在_20°C保存备用。
[0032]S2 所述定性 PCR 反应体系为 25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，J101-1/2 分别0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L ；
S2所述定性PCR反应程序为:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，30个循环。扩增产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0033]实施例2 JlOl定性PCR的特异性试验
本发明采用多种农作物进行特异性实验，以下以7种农作物作为举例进行说明。以转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆转基因大豆GTS40-3-2、非转基因大叶苜蓿、(均来自常规随机取样后储存，并不因此限定本发明范围)和苜蓿草JlOI基因组DNA为模板，采用本发明建立的转基因苜蓿JlOl品系特异性定性PCR方法进行扩增，检测本发明建立的定性PCR方法的特异性。实验结果见附图2所示，经PCR扩增后电泳分析观察有无170bp条带。实验结果表明，只有JlOl有特征性扩增170bp长度的片段，其他作物均无条带出现。表明本发明建立的JlOl品系特异性的定性PCR方法特异性良好。
[0034]定性PCR 反应体系为 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分别 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反应程序为:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0035]实施例3 JlOl定性PCR的灵敏度试验
采用本发明建立的转基因苜蓿JlOl品系特异性定性PCR方法进行扩增，采用10ng/μ L、16ng/ μ L、0.16ng/ μ L、0.08ng/ μ L、0.016ng/ μ L 及 0.008ng/ μ L 的 JlOl 品系的基因组DNA为模板进行检测，实验结果如图3所示。在模板量不少于0.08ng时，特异性201bp的片段能扩增出来。表明其灵敏度为0.08ng基因组DNA，相当于50拷贝的基因组DNA。
[0036]定性PCR 反应体系为 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分别 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反应程序为:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
【权利要求】
1.一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测用引物，其特征在于，其DNA序列分别如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.权利要求1所述转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测用引物在转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方面的应用。
3.—种转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.提取DNA作为反应的模板； 52.采用权利要求1所述的引物进行定性PCR检测； 其中，S2所述定性PCR检测的反应体系为25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，权利要求1所述的引物各为0.5 μ L，DNA模板I μ L，ddH20 10.5 μ L ； S2所述定性PCR检测的反应程序为:98°C 10s，60°C 30s, 72°C 30s, 30个循环；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
4.权利要求3所述转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方法在转基因苜蓿草JlOl品系与其他作物的检测鉴别方面。
5.根据权利要求4所述转基因苜蓿草JlOl品系特异性定性PCR检测方法的应用，其特征在于，应用于转基因苜蓿草JlOl品系与转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆转基因大豆GTS40-3-2、非转基因大叶苜蓿的检测鉴别方面。
【文档编号】C12N15/11GK104372088SQ201410631655
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】卢丽, 刘二龙, 吕英姿, 蒋湘, 唐婕, 樊武疆, 姚柏辉, 王定国, 林惠娇, 郑高彬, 林学勤, 秦焯敏 申请人:中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局