一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，属于发酵工程【技术领域】。本发明以重组毕赤酵母N24菌株为发酵菌种，首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加含小麦B淀粉浆的补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶。该方法工艺简单，酶活力高，环保无污染，具有较高的经济和社会效益。
【专利说明】—种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵工程【技术领域】，具体地涉及一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002]β_葡聚糖酶属半纤维素酶类，广义而言，包括了一切能分解β_糖苷键连成的葡萄糖聚合物的酶系。由于作用方式的不同，可分为内切和外切β_葡聚糖酶两类，按其所作用的不同糖昔糖类型，又分为如内切β_1，4葡聚糖酶，外切β_1，3葡聚糖酶等酶种；而在啤酒生产中，则特指能分解大麦胶的大麦β_葡聚糖酶。微生物中，细菌、线菌和霉菌均能产生线菌和霉菌均能产生葡聚糖酶，但绝大多数菌株的酶系对大麦葡聚糖无特异性，只分解由β_1，2、β-1，3、β-1，4和β_1，6键分别构成的纤维素及昆布聚糖等，这些产酶菌广泛存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中，如娄地青霉和木素木霉等。而能特异分解大麦β_葡聚糖的酶主要来源于芽袍杆菌属和曲霉属，国内外已报道的有:枯草杆菌、地衣芽饱杆菌、短杆菌、黑曲霉、米曲霉、臭曲霉、冻土毛霉和溶黄质厄氏菌等，该产品可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β -葡聚糖，在饲料中可用于降低非淀粉多糖(NSP)及其抗营养因子的含量，改善畜禽对营养物质的吸收，提高畜禽的生长速度和饲料转化效率。在啤酒酿造上用于降低麦汁黏度，改善过滤性能，提高麦芽溶出率，防止啤酒浑浊，稳定啤酒质量；在啤酒生产糖化过程中，添加该酶对缩短麦汁的过滤时间有明显的效果。尤其是对用大麦作辅料或者当大麦、麦芽质量较差时，效果最佳。
[0003]小麦加工主要是面粉生产，并可进一步深加工成小麦淀粉和谷朊粉及相应转化产品。在小麦淀粉生产过程中，由于小麦本身化学组成、加工工艺等因素，又会产生小麦Α、B两种淀粉，A淀粉是精制淀粉，含蛋白质等杂质很少，可作为成品淀粉，广泛使用于各行各业；也可进一步深加工成变性淀粉、淀粉糖等淀粉衍生物，从而提高其附加值。B淀粉是生产A淀粉时由离心脱水机刮下来的“废物”，又称尾淀粉、淤渣淀粉、刮浆淀粉或淀粉糊精，通常可达原料面粉总质量的20%左右，它主要是由小的淀粉粒、损伤的大淀粉颗粒以及少量细胞壁物质、面筋碎片、戊聚糖和色素组成。小麦B淀粉浆在现有工艺中通常是做废水处理掉，但是此废水成分复杂、浓度高，一直是水处理的难题之一；若直接排放会对水体及周边环境产生污染，治理污染的成本更高。此外，近些年来也有利用小麦B淀粉浆制高麦芽糖浆、麦芽糊精、食品添加剂、酒精及柠檬酸及α淀粉等方面的报道出现。
[0004]目前国内外主要利用微生物法生产β_葡聚糖酶，其中能特异分解β_葡聚糖的酶类主要来源于芽抱菌属和霉属(黑曲霉、木霉)的代谢产物。但是对于真核毕赤酵母产葡聚糖酶的研究仍然较少。CN 102559641 A公开了一种重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶方法，该方法利用重组毕赤酵母作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、酵母氮源、生物素、甘油、H3P04、CaSO4.2H20、K2SO4, MgSO4.7H20、KOH为原料，进行液体深层发酵生产β -葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，过滤后得到滤渣及β -葡聚糖酶滤液；所得到的β-葡聚糖酶滤液在经过超滤和喷雾干燥后得到粉状β-葡聚糖酶产品；所得滤渣干燥后可以作为饲料添加剂，不产生任何废弃物，实现了 β_1，3-1，4-葡聚糖酶的高产率发酵，使本发明可以适用于工业生产。但是本发明所采用原料均为合成原料，成本较高。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足提供一种重组毕赤酵母生产β -葡聚糖酶的方法，该方法工艺简单，酶活力高，变废为宝，环保无污染。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种重组毕赤酵母生产β -葡聚糖酶的方法，以重组毕赤酵母Ν24为发酵菌种，首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶，包括以下步骤:
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母Ν24菌株在无菌条件下取f2环接种于500mLYPD培养基中，装液量为40% (v/v)，于30°C、220r/min培养24h，制备一级种子；以10%接种量，将一级种子接种于5L的扩大培养基中，装液量为50%(v/v)，于30°C、220r/min培养18h，制备二级种子；
②增值培养阶段:无菌条件下，将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中，调节初始pH值为5.5飞.0，培养温度3(T32°C，初始通气比1:0.6，搅拌转速为200r/min，开始发酵；发酵8?16h，以120mL/h的速率流加补料培养基；16?24h，以180mL/h的速率流加补料培养基；24tT40h，以60mL/h的速率流加补料培养基；
③诱导产酶阶段:当增殖培养阶段的葡萄糖含量低于1.0g/L以下，溶氧上升至60%(v/v)以上时，开始补加甲醇溶液进行诱导产酶；所述诱导产酶分三个阶段，第一阶段:(Γ24小时，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.(Tl.5mL/h ;第二阶段:24?72h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5^2.0mL/h ;第三阶段:72?96h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5?3.0mL/h。
[0007]进一步的，所述增殖培养基的组成为，玉米浆l(T30g/L，硫酸二氢钾4?6g/L，硫酸镁f 3g/L，余量为小麦B淀粉浆。
[0008]进一步的，所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为3(T50g/L。
[0009]进一步的，所述补料培养基含小麦B淀粉浆。
[0010]进一步的，所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为5(Tl00g/L。
[0011]进一步的，所述小麦B淀粉浆含PTMl 10mL/L。
[0012]进一步的，所述PTMl 的组成为:CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L，MnSO4.H2O3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
[0013]进一步的，所述甲醇溶液含PTMl 10mL/L。
[0014]进一步的，所述PTMl 的组成为:CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L，MnSO4.H2O3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
[0015]本发明的有益效果在于:本发明一种重组毕赤酵母生产β_葡聚糖酶的方法，通过菌种制备及扩大培养、增值培养及诱导产酶这三个阶段，以小麦B淀粉浆为主要营养物质，配以玉米浆、硫酸二氢钾、硫酸镁等成分，通过合适的发酵工艺条件，得到了重组毕赤酵母有效利用小麦B淀粉浆发酵生产木聚糖酶的方法。此外，以小麦B淀粉浆为主要原料，不仅实现了农副产品的高附加值利用，有利于环保，具有较高的社会价值；也为小麦深加工提高了产品的附加值，为提高企业的经济效益开辟了一条新的途径。该方法工艺简单，酶活力高，环保无污染，具有较高的经济和社会效益。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步地详细说明。
[0017]实施例一
本发明重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，以重组毕赤酵母N24为发酵菌种，首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶，可按以下步骤进行:
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母Ν24菌株在无菌条件下取f2环接种于500mLYPD培养基中，装液量为40% (v/v),于30°C、220r/min培养24h，制备一级种子；以10%接种量，将一级种子接种于5L的扩大培养基中，装液量为50% (v/v),于30°C、220r/min培养18h，制备二级种子；
②增值培养阶段:无菌条件下，将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中，其组成为玉米浆30g/L，硫酸二氢钾4g/L，硫酸镁3g/L，余量为小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50g/L，调节初始pH值为5.5，培养温度30°C，初始通气比1:0.6，搅拌转速为200r/min，开始发酵；发酵8?16h，以120mL/h的速率流加补料培养基；16?24h，以180mL/h的速率流加补料培养基；24tT40h，以60mL/h的速率流加补料培养基，其中，所述补料培养基含小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50g/L ;此步骤中，所述小麦B淀粉浆含PTMl 10mL/L ；
③诱导产酶阶段:接种后45h，葡萄糖含量为0.5g/L，消耗殆尽，溶氧开始上升，当溶氧量达70% (v/v),开始补加甲醇溶液进行诱导产酶；所述诱导产酶分三个阶段，第一阶段:(Γ24小时，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h ;第二阶段:24?72h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h ;第三阶段:72?96h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h ;所述甲醇溶液均含PTMl 10mL/L。
[0018]其中，步骤②③中，所述PTMl 的组成为:CuS04.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L,MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
[0019]葡聚糖酶活性的测定方法统一为:采用DNS法，在pH4.8、50°C条件下，每分钟分解底物生成1.0 μ moL还原糖(以葡萄糖计)所需酶量为I个活力单位。
[0020]经测定，本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1905.20U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比，提高12%。
[0021]实施例二
本发明重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，以重组毕赤酵母N24为发酵菌种，首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶，可按以下步骤进行::
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母Ν24菌株在无菌条件下取f 2环接种于500mLYPD培养基中，装液量为40% (v/v),于30°C、220r/min培养24h，制备一级种子；以10%接种量，将一级种子接种于5L的扩大培养基中，装液量为50%(v/v)，于30°C、220r/min培养18h，制备二级种子；
②增值培养阶段:无菌条件下，将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中，其组成为玉米浆20g/L，硫酸二氢钾5g/L，硫酸镁lg/L，余量为小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为30g/L，调节初始pH值为5.8，培养温度31 °C，初始通气比1:0.6，搅拌转速为200r/min，开始发酵；发酵8?16h，以120mL/h的速率流加补料培养基；16?24h，以180mL/h的速率流加补料培养基；24tT40h，以60mL/h的速率流加补料培养基；其中，所述补料培养基含小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为80g/L ;此步骤中，所述小麦B淀粉浆均含PTMl 10mL/L ；
③诱导产酶阶段:接种后46h，葡萄糖含量为lg/L，消耗殆尽，溶氧开始上升，当溶氧量达65% (v/v)，开始补加甲醇溶液进行诱导产酶；所述诱导产酶分三个阶段，第一阶段:(Γ24小时，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.2mL/h ;第二阶段:24?72h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h ;第三阶段:72?96h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h ;所述甲醇溶液含PTMl 10mL/L。
[0022]其中，步骤②③中，所述PTMl 的组成为:CuS04.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L,MnS04.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
[0023]经测定，本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1814.50U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比，提高11.5%。
[0024]实施例三
本发明重组毕赤酵母生产β -葡聚糖酶的方法，以重组毕赤酵母Ν24为发酵菌种，采用一步发酵法，菌种首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶，可按以下步骤进行::
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母Ν24菌株在无菌条件下取f2环接种于500mLYPD培养基中，装液量为40% (v/v),于30°C、220r/min培养24h，制备一级种子；以10%接种量，将一级种子接种于5L的扩大培养基中，装液量为50%(v/v)，于30°C、220r/min培养18h，制备二级种子；
②增值培养阶段:无菌条件下，将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中，其组成为玉米浆10g/L，硫酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，余量为小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为40g/L，调节初始pH值为6.0，培养温度32°C，初始通气比1:0.6，搅拌转速为200r/min，开始发酵；发酵8?16h，以120mL/h的速率流加补料培养基；16?24h，以180mL/h的速率流加补料培养基；24tT40h，以60mL/h的速率流加补料培养基；其中，所述补料培养基含小麦B淀粉浆，其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为100g/L ;此步骤中，所述小麦B淀粉浆均含PTMl 10mL/L。
[0025]③诱导产酶阶段:接种后48h，葡萄糖含量为0.8%，消耗殆尽，溶氧开始上升，当溶氧达60% (v/v)，开始补加甲醇溶液进行诱导产酶；所述诱导产酶分三个阶段，第一阶段:(Γ24小时，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.0mL/h ;第二阶段:24?72h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h ;第三阶段:72?96h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入3.0mL/h ;所述甲醇溶液含PTMl 10mL/L。
[0026]其中，步骤②③中，所述PTMl 的组成为:CuS04.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L,MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
[0027]经测定，本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1735.75U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比，提高10%。
【权利要求】
1.一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，以重组毕赤酵母N24为发酵菌种，其特征在于:首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养，然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养，最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶，包括以下步骤: ①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母Ν24菌株在无菌条件下取广2环接种于500mLYPD培养基中，装液量为40% (v/v),于30°C、220r/min培养24h，制备一级种子；以10%接种量，将一级种子接种于5L的扩大培养基中，装液量为50%(v/v)，于30°C、220r/min培养18h，制备二级种子； ②增值培养阶段:无菌条件下，将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中，调节初始pH值为5.5飞.0，培养温度3(T32°C，初始通气比1:0.6，搅拌转速为200r/min，开始发酵；发酵8?16h，以120mL/h的速率流加补料培养基；16?24h，以180mL/h的速率流加补料培养基；24tT40h，以60mL/h的速率流加补料培养基； ③诱导产酶阶段:当增殖培养阶段的葡萄糖含量低于10g/L以下，溶氧上升至60%(v/v)以上时，开始补加甲醇溶液进行诱导产酶；所述诱导产酶分三个阶段，第一阶段:(Γ24小时，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.(Tl.5mL/h ;第二阶段:24?72h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5^2.0mL/h ;第三阶段:72?96h，甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5^3.0mL/h。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述增殖培养基的组成为，玉米浆l(T30g/L，硫酸二氢钾r6g/L，硫酸镁f 3g/L，余量为小麦B淀粉浆。
3.如权利要求2所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为3(T50g/L。
4.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述补料培养基含小麦B淀粉浆。
5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为5(Tl00g/L。
6.如权利要求广5的任一项所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述小麦B淀粉浆中含PTMl 10mL/L。
7.如权利要求6所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述PTMl 的组成为:CuS04.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnS04.H2O 3.0g/L, Na2Mo04.2H200.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
8.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述甲醇溶液中含PTMl 10mL/L。
9.如权利要求8所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法，其特征在于:所述PTMl 的组成为=CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnS04.H2O 3.0g/L, Na2Mo04.2H20.0.2g/L, H3BO3 0.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L。
【文档编号】C12N9/42GK104328099SQ201410638573
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】闫德冉, 赵子高, 高楠, 杨付伟, 刘乐 申请人:河南天冠纤维乙醇有限公司