一种山药原生质体的制备及纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种山药原生质体制备及纯化方法。选取山药幼叶，消毒处理；将叶片切成细条放入酶解液，黑暗条件下酶解去除细胞壁；酶解混合物在水平摇床上处理，充分释放原生质体；然后用尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管，过滤产物离心后弃上清，加入洗涤液，轻缓颠倒使细胞悬浮；离心分离原生质体，去上清，加入原生质体保存液，重新悬浮细胞后静置，使原生质体自然沉降；最后吸取上层细胞悬液，得到纯化的山药原生质体。本发明原材料易得，消毒方法对外植体的损伤较小，消毒效果好，污染率低；针对山药叶片特性优化了酶解体系和条件，获得的原生质体产量大，活性高；采用自然沉降的方法，可减少细胞碎片等杂质，获得较高纯度的原生质体。
【专利说明】一种山药原生质体的制备及纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及原生质体的制备、纯化，具体涉及一种山药原生质体的制备及纯化方法，属于植物组织培养和细胞工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]原生质体是植物细胞去除细胞壁后的产物，具有该细胞的所有生命特性，可应用于植物细胞发育学、生理学、病毒学等诸多方面的研究，如可利用原生质体研究细胞壁再生、细胞器摄入、细胞分裂等植物生理学课题。由于排除了细胞壁的障碍，易于导入外源基因，原生质体也被广泛应用于转基因研究，特别是在遗传育种方面，原生质体是最基础的实验材料。山药研究在我国相对薄弱，山药原生质体制备工作尚未见报道。通常，植物的很多器官，如根、茎、叶、子叶、愈伤组织和培养细胞等，都可以用来制备原生质体。但要获得易于分离、产量高、生物活性好的原生质体，选择合适起始材料是原生质体培养成功的关键因素之一。已有报道不同植物原生质体的制备方法，但针对特定的植物原生质体的制备，必须根据不同外植体的特性，借鉴以往的方法并加以改良、优化。为避免污染，以往的方法多利用组织培养苗的外植体，愈伤组织、或悬浮培养细胞制备无菌原生质体。但这些做法所需的时间较长，耗费很多材料和精力。且最大的缺陷是材料来源有限。以往的原生质体在纯化过程中，一般通过离心方式，难以去除酶解产物中大量的细胞碎片，且过多的离心容易造成对脆弱的原生质体活性的损害。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种山药原生质体的制备及纯化方法，使原生质体制备时间缩短，并能保证原生质体产量和质量。
[0004]本发明的技术方案是:一种山药原生质体的制备及纯化方法，首先选取山药幼叶，消毒处理；然后将叶片切成细条放入酶解液中，在黑暗条件下酶解去除细胞壁；接着将酶解混合物在水平摇床上处理，使原生质体充分释放；用尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管中，将过滤产物离心后弃上清；加入洗涤液，轻缓颠倒使细胞悬浮；离心分离原生质体，去上清；再加入原生质体保存液，重新悬浮细胞后静置，使原生质体自然沉降；最后吸取上层细胞悬液，得到纯化的山药原生质体。
[0005]进一步地，本发明所述的一种山药原生质体的制备及纯化方法，包括下列步骤:
[0006]①选取山药幼叶，进行消毒处理；
[0007]②原生质体的制备:将叶片切成0.5111111的细条后，放入酶解液中，置于黑暗条件下，251酶解21！；
[0008]③原生质体的纯化:将酶解混合物在水平摇床上以80170111摇5111111，用45 4 III的尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管中，1008离心501！！，弃上清；再加入适量洗涤液，轻缓颠倒悬浮细胞，100^离心5111111，弃上清；再加入适量原生质体保存液，重悬浮后，放置20-1让原生质体自然沉降，吸取上层细胞悬液，弃沉淀，得到纯化的山药原生质体。
[0009]更进一步地，对山药幼叶消毒的方法是:自来水冲洗100111，75%乙醇浸泡308，用无菌去离子水漂洗两次，1:25巴氏消毒液浸泡20111111，用无菌去离子水漂洗两次。
[0010]更进一步地，所述酶解液配方为:1.5%纤维素酶卜10，0.4%果胶酶，0.41甘露醇，20禮 1(01,201111 腿3，10禮 €^,0.1%83八。
[0011]再进一步地，所述原生质体洗涤液配方:150禮^01,12011)1 0^12、5禮％1、2禮128 (邱5.8)。
[0012]本发明的有益效果是:(1)利用大田栽培植株的叶片制备原生质体，材料容易获得；⑵消毒方法对外植体的损伤较小，消毒效果好，污染率低；(3)针对山药叶片的特性优化了酶解体系和条件，获得的原生质体产量大，活性高；(4)自然沉降的方法可减少细胞碎片等杂质，获得较高纯度的原生质体；同时本发明对原生质体的损伤比较小，尽可能保留了原生质体的活性，为提高后续实验的成功率提供了保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1(图匕和图1幻为采用传统离心法与本发明的自然沉降法获得的山药原生质体可见光照片比对；
[0014]图2(图23和图2幻为采用传统离心法与本发明的自然沉降法获得的山药原生质体(与图1相同视野)经二乙酸荧光素(印八)染色后的荧光照片比对。
【具体实施方式】
[0015]本发明是对其它植物原生质体制备方案进行改良优化，发明了山药原生质体的制备及纯化方法。以山药幼叶直接作为起始材料，对酶解液配方、酶解时间、山药原生质体制备及纯化方案进行了探索。采用纤维素酶&10和果胶酶为消化酶，在合适的酶解液体系中，对山药幼叶组织进行适当时间的酶解消化，过滤后离心收集细胞，用洗涤液洗涤细胞，然后利用自然沉降的方法使原生质体和其他细胞碎片分离，获得了高纯度的山药原生质体。
[0016]根据本发明技术方案，首先选取山药幼叶，消毒处理；然后将叶片切成细条放入酶解液中，在黑暗条件下酶解去除细胞壁；接着将酶解混合物在水平摇床上处理，使原生质体充分释放；用尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管中，将过滤产物离心后弃上清；加入洗涤液，轻缓颠倒使细胞悬浮；离心分离原生质体，去上清；再加入原生质体保存液，重新悬浮细胞后静置，使原生质体自然沉降；最后吸取上层细胞悬液，得到纯化的山药原生质体。
[0017]下面结合附图以具体实例对本发明技术方案作进一步说明，所列举的仅为典型范例，凡操作条件等同或类似替换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
[0018](1)叶片消毒处理
[0019]配制消毒液:75%乙醇；1: 25巴氏消毒液。
[0020]选取山药幼叶，自来水冲洗10111111。后续操作均须在无菌条件下完成。将叶片在75%乙醇中浸泡308 ；用无菌去离子水漂洗两次；将叶片在1: 25巴氏消毒液浸泡20111111 ；用无菌去离子水漂洗两次。
[0021](2)原生质体的制备
[0022]配制酶溶液:加入纤维素酶卜10、果胶酶、甘露醇、；551水浴10-11,以使酶活化并使蛋白酶失活；放置到室温后，加入(^(^，8“ ；用11的1(0?调酸碱度至邱5.8 ；用0.45 9 ！！！微孔滤膜过滤除菌。
[0023]酶溶液配方为:1.5%纤维素酶 8-10，%1，20禮128,10禮 0^012,0.1% 83八。
[0024]原生质体的制备:用刀片将山药幼叶切成0.5111111的细条，将叶片细条放入酶解液中；置于黑暗条件下，251酶解2小时。
[0025](3)原生质体的纯化
[0026]配制原生质体洗涤液:150禮^01,120禮1(01,21111 123(^5.8)。
[0027]原生质体保存液配方:150禮^01,1201111 ^1^5^ 1(01,21111 12&0.41 甘露醇(邱5.8)。
[0028]原生质体的纯化:将酶解混合物在水平摇床上以8017^111钟摇5-11,加等体积的洗涤液，混匀；用45 9 ！:！的尼龙网膜将酶解产物过滤至50“离心管中。轻缓颠倒悬浮细胞，1008离心力下离心5111111，小心吸去上清；加适量洗漆液，轻缓颠倒悬浮细胞，1008离心力下离心5111111，小心吸去上层溶液；加适量原生质体保存液，轻缓颠倒悬浮液，放置20111111，让原生质体自然沉降；吸取上层细胞悬液，弃沉淀，保存。
[0029]本发明提供的这种山药原生质体的制备及纯化方法，其原材料易得，消毒方法对外植体的损伤较小，消毒效果好，污染率低；针对山药叶片的特性优化了酶解体系和条件，获得的原生质体产量大，活性高；采用自然沉降的方法，可减少细胞碎片等杂质，获得较高纯度的原生质体。
[0030]图1为采用传统离心法与本发明的自然沉降法获得的山药原生质体可见光照片比对。其中，图匕为离心法获得的原生质体可见光照片，图化为自然沉降法获得的原生质体可见光照片。从图1比对结果可以发现，采用本发明自然沉降法获得的原生质体(图化)比传统离心法获得的原生质体(图1幻细胞碎片较少，更为纯净。
[0031]图2为采用传统离心法与本发明的自然沉降法获得的山药原生质体(与图1相同视野)经二乙酸荧光素(印八)染色后的荧光照片比对。其中，图23为传统离心法获得的山药原生质体经二乙酸荧光素(印八)染色后的荧光照片，图此为本发明的自然沉降法获得的山药原生质体经二乙酸荧光素(印八)染色后的荧光照片。从图2所示并结合观察可见光照片可见，采用本发明的自然沉降法获得的原生质体经？0八染色后(图24，被？0八染色的细胞数占总细胞数的比例较高，说明活细胞比例较高。
【权利要求】
1.一种山药原生质体的制备及纯化方法，其特征在于:首先选取山药幼叶，消毒处理；然后将叶片切成细条放入酶解液中，在黑暗条件下酶解去除细胞壁；接着将酶解混合物在水平摇床上处理，使原生质体充分释放；用尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管中，将过滤产物离心后弃上清；加入洗涤液，轻缓颠倒使悬浮细胞；离心分离原生质体,去上清；再加入原生质体保存液，重新悬浮细胞后静置，使原生质体自然沉降；最后吸取上层细胞悬液，得到纯化的山药原生质体。
2.根据权利要求1所述的一种山药原生质体的制备及纯化方法，其特征在于包括下列步骤: ①选取山药幼叶，进行消毒处理； ②原生质体的制备:将叶片切成0.5mm的细条后，放入酶解液中，置于黑暗条件下，25°C 酶解 2h ； ③原生质体的纯化:将酶解混合物在水平摇床上以80r/min摇5min,用45μ m的尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管中，10g离心5min，弃上清；再加入适量洗涤液，轻缓颠倒悬浮细胞，10g离心5min,弃上清；再加入适量原生质体保存液，重悬浮后，放置20min,让原生质体自然沉降，吸取上层细胞悬液，弃沉淀，得到纯化的山药原生质体。
3.根据权利要求2所述的一种山药原生质体的制备及纯化方法，其特征在于:所述步骤①中消毒处理为:自来水冲洗1min, 75%乙醇浸泡30s,用无菌去离子水漂洗两次，I: 25巴氏消毒液浸泡20min,用无菌去离子水漂洗两次。
4.根据权利要求2所述的一种山药原生质体的制备及纯化方法，其特征在于:所述步骤②中酶解液配方为:1.5%纤维素酶1?-10，0.4%果胶酶，0.41甘露醇，201111 KCl,20mMMES, 1mM CaCl2,0.1% BSA。
5.根据权利要求2所述的一种山药原生质体的制备及纯化方法，其特征在于:所述步骤③中原生质体洗涤液配方:150mM NaCl, 120mM CaCl2, 5mM KCl,2mM MES (pH 5.8)。
【文档编号】C12N5/04GK104357376SQ201410652045
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】张敏跃 申请人:张敏跃