融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种I-TevIN201-Cas9null融合蛋白及其应用，属于分子生物学领域，本发明通过将I-TevIN201的N端201氨基酸和Cas9null（没有切割活性）的N端融合，得到一种I-TevIN201-Cas9null融合蛋白，该蛋白在gRNA的引导下，可以序列特异性的切割CNNNG位点，达到精确切割基因组的作用，从而使细胞的脱靶效应大大降低；此外利用本发明所得I-TevIN201-Cas9null融合蛋白做药物筛选或基因修饰时更安全，该蛋白还可用于基因治疗。
【专利说明】I -Tev I圓-〇359。。| I融合蛋白及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白及其应 用。
[0003]
【背景技术】
[0004] CRISPR-化S源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用祀点特异性的RNA将化s9核酸 酶带到基因组上的具体祀点，从而对特定基因位点进行修饰。RNA导向化s9可W在多种细 胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。化s9该种基因组编辑的潜能使该项 技术已经广泛用于人的细胞系，小鼠，大鼠，多物种的基因敲除及敲入。
[0005] I-TevI是一种归巢酶，它有N末端的催化结构域，中间的链接区域和C末端的DNA 结合域构成。该酶序列特异性的识别CNNNG序列。
[0006] 特异性的浊NA祀向的化s9基因敲除技术已经有了比较广的应用，但是该技术存 在很大的不足，就是脱祀效应。为了提高打祀的特异性，有很多改进，比如选择多个浊NA打 祀，然后进行脱祀效应分析，此外，还有用两个突变型的化s9即Cas9 nickase，用两个gRNA 引导化s9 nickase去进行切割。还有的科学家用失活的化s9即化s9duii，连接一个化rkl 蛋白（Cas9"uii-ForkI )，对特定基因位点进行修饰，但是仍然存在脱祀效应。为了最大程度 上提高其特异性，我们用失活的化s9即化s9"uii和特异性识别CNNNG序列的I-TevI W2CU蛋 白融合，形成一个浊NA祀向的，特异性切割CNNNG序列工具酶，该工具酶可W对基因组进行 精确的基因编辑。
[0007]
【发明内容】
[000引解决的技术问题： 本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白，即将 I-Tevlw2cu的N端201氨基酸和化s9。。11 (没有切割活性）的N端融合。该蛋白在浊NA的引 导下，可W序列特异性的切割CNNNG位点，达到精确切割基因组的作用，使产生的脱祀效应 大大降低。
[000引技术方案： I-TevI胃-Cas9"ii融合蛋白，所述融合蛋白为由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的 蛋白。
[0010] 所述的I-TevlN2cn-化s9"uii融合蛋白的核巧酸序列。
[0011] W上所述的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[001引所述的I-TevI胃-Cas9"uii融合蛋白，其第十位天冬氨酸突变成丙氨酸，第839位 组氨酸突变成丙氨酸，第840位组氨酸突变成丙氨酸，第863位天冬醜胺突变成丙氨酸，该 突变蛋白没有核酸酶活性。
[001引所述的I-TevlN20i-Cas9n山1融合蛋白，其中I-TevlN20i蛋白由归巢酶I-TevI N末端 201个氨基酸组成，包含I-TevI的酶的催化活性区域和连接域。
[0014] 所述的I-TevlN2cn-Cas9nuii融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
[0015] 所述的I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白的基因可W克隆到真核表达载体上，用于细胞 和动物的基因修饰。
[0016] 有益效果 本发明通过将I-Tevlw2cu的N端201氨基酸和化s9。。11 (没有切割活性）的N端融合， 得到一种I-Tevlw2cn-化s9"ii融合蛋白，该蛋白在gRNA的引导下，可W序列特异性的切割 CNNNG位点，达到精确切割基因组的作用，从而使细胞的脱祀效应大大降低；此外利用本发 明所得I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白做药物筛选或基因修饰时更安全，该蛋白还可用于基因 治疗。
[0017] 现有的技术对基因组切割都是序列非特异的切割，gRNA的引导下，化s9蛋白可W 在浊NA序列上，序列两边做随意的切割。而本发明I-Tevlw2cu-化s9"uii融合蛋白可W精确 的进行序列特异性的切割，在浊NA的引导下，特异性的识别切割CNNNG序列。所W，它的特 异性和可控性非常大，因此，本发明的应用更广，更实用。
[0018]
【专利附图】
【附图说明】
[001引图1为I-TevlN20rCas9nuu蛋白活性的验证图，由图可见为I-TevlN20i-Cas 9nuu蛋白 与线性化的质粒PDNA3. 1，tracrRNA，Mg", gRNA赔育该一组，DNA有切割活性，其他组没有 切割活性； 图2为PCR扩增Srebf2基因，回收PCR产物的测序结果图(野生型对照）； 图3为1-16乂1,2。1-化39。山凍白对5'66'2基因切割活性验证图，将1-16乂1,2。1-化39。山1 真核表达载体和浊NA载体同时转染小鼠L929细胞，经过Hygromycin筛选，挑取一个单克 隆。回收PCR产物送测序，结果显示与野生型对照对比，I-Tevlw2cii-化s9"uu蛋白对Srebf2 基因都有切割活性。
[0020] 图4为I-Tevlw2cu-Cas9"uii蛋白对Srebf2基因切割活性验证图，将 I-TevlN2cu-化s9"uii真核表达载体和浊NA载体同时转染小鼠L929细胞，经过Hygromycin 筛选，随机再挑取第二个单克隆。回收PCR产物送测序，结果显示与野生型对照对比， I-Tevlw2cu-Cas9"uii蛋白对Srebf2基因都有切割活性。
[0021]
【具体实施方式】
[0022] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0023] 本发明中，引物 Prime;r_F、引物 Prime;r_ R、引物 I-TevlN2cii-化s9nuii _F: Ndel、引 物I-TevI胃-化s9"uii _R;、各引物购于生工生物工程化海）股份有限公司；原核表达载体 pET-1化购于Novagen;大肠杆菌E. coli E5L21购于"TakarasIPTG购于"Takara;胶回收试 剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；小鼠L929细胞购于博研（上海）生物科技有限 公司，I-Tevlwwr化s9nuiiDNA序列是委巧生工生物工程（上海）股份有限公司合成的。
[0024] 实施例1 I-Tevlw2cn-Cas9"ii蛋白的表达与纯化 方法如下： 第一部分；I-Tevlw2cii-化s9duii真核表达载体的构建： 序列合成 I-TevlN2cu-Cas9"uii，W I-TevlN2cn-Cas9"uiiDNA 序列（SEQ ID NO. 2)为模板， 用引物 Primer_F;CAGCCTCCGGACTCTAGAATGAAAAGCGGAATTTATCAGAT (沈Q ID NO. 3)和引 物 Primer_ R: AACTCATTACTAACCGGTCACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTC (沈Q ID NO. 4)扩增 I-TevlN2cu-Cas9"uii，克隆到 hCas9 载体的甜al&Agel 位点，构建成 pI-TevlN2cn-Cas9"uii载体。
[0025] 具体的扩增步骤如下： PCR扩增I-Tevlw2(ii-化s9"ii，配置反应体系和反应程序如下： 表1反应体系
【权利要求】
1. I-TevIN2Q1-CaS9 nullffi合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为由SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列组成的蛋白。
2. 编码权利要求1所述的I-TevI N2(ll_Cas9null融合蛋白的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、i〇
4. 根据权利要求1所述的I-TevI N2(ll_Cas9null?合蛋白，其特征在于，其第十位天冬氨 酸突变成丙氨酸，第839位组氨酸突变成丙氨酸，第840位组氨酸突变成丙氨酸，第863位 天冬酰胺突变成丙氨酸，该突变蛋白没有核酸酶活性。
5. 根据权利要求1所述的I-TevI N2Q1-CaS9nullffi合蛋白，其特征在于，其中I-TevI疆蛋 白由归巢酶I-TevI N末端201个氨基酸组成，包含I-TevI的酶的催化活性区域和连接域。
6. 权利要求1所述的I-TevI N2(ll-Cas9nullffi合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
【文档编号】C12N15/52GK104513814SQ201410656386
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】李云英 申请人:李云英