一种提高异亮氨酸产量的发酵方法
【专利摘要】本发明公开一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，包括如下操作步骤：培养菌种、发酵、发酵液分离、发酵清液离子交换、脱氨塔脱氨、活性炭脱色和蒸发结晶。本发明用培养基中玉米浆水解液总重量的40%代替传统工艺中用盐酸调节pH的做法，避免了盐酸对不锈钢材质的罐体的腐蚀。另外该工艺中用生物素及VB1作为生长因子，降低了料液的黏度，更加有利于菌体的呼吸代谢，同时有利于下游成品的提取。本发明的发酵指标较好；异亮氨酸代谢产物产量明显提高，平均产酸可以达到36.9g/L，比改进前平均提高30%；异亮氨酸代谢产物转化率提高 2-4%，发酵周期缩短了10h。
【专利说明】一种提高异亮氨酸产量的发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于氨基酸生产【技术领域】，具体涉及一种提高异亮氨酸产量的发酵方法。
【背景技术】
[0002] L-异亮氨酸作为支链氨基酸之一，系人体必需氨基酸，具有多种生理功能。因其特 殊的结构和功能，在人类生命代谢中占特别重要的地位，主要用以配制氨基酸输液、合成多 肽药物和食品抗氧化剂等，尤其在医学研究和治疗中的作用日益受到重视。它在血脑屏障、 肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗、先天性代谢缺陷病的膳食治疗、表血症及术后 糖尿病患者的治疗、加快外科创伤愈合、肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。而我国支链 氨基酸成本降不下来，并且产品质量差，价格上不去，大部分的支链氨基酸都只能用在饲料 的生产上，质量达不到医药级。此外，国内产酸率最高达到28-33 g/L，而异亮氨酸在国外已 经实现大规模工业化生产，产酸水平已达到30-35 g/L以上；从产率上来讲，目前发酵法生 产异亮氨酸的最高转化率仅为18-20%。国内许多氨基酸厂都迫切需要高品质、低成本的生 产技术。因此，对发酵工艺进行技术创新，使异亮氨酸的生产技术指标得到提高，特别是糖 酸转化率的提高使生产成本得到下降，促进我国支链氨基酸行业的健康快速发展非常有必 要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术中发酵法生产异亮氨酸的产量低、转化率低的技术 问题，提供一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，该方法的发酵指标均较好，异亮氨酸代谢产 物产量明显提高，平均产酸可以达到36. 9g/L。
[0004] 本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，步 骤如下： 步骤一、培养菌种 把菌体划线接种于活化斜面，31°c恒温培养36-40h，在菌种室扩大培养生产一级种子， 然后将得到的一级种子接入二级种子罐中继续扩大培养，向二级种子培养基中通入无菌空 气，通气量为〇. 5V/V/M-0. 8V/V/M，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养，得到二 级种子培养液，备用； 步骤二、发酵 将二级种子培养液接入到装好发酵培养基的发酵罐中，二级种子培养液的体积为发酵 培养基体积的15%-20% ;通入无菌空气，连续发酵50-60h ;温度从开始发酵到发酵25h的过 程中控制为31-32°C，发酵25h后控制为32. 5-33°C;溶氧从开始发酵到发酵12h的过程中控 制为不低于18. 75mol/L，发酵12h后控制为11. 25-15. 62mol/L ;pH从开始发酵到发酵36h 的过程中控制为6. 8-7. 0,发酵36h后控制为7. 0-7. 2 ;发酵过程中控制残糖的质量百分数 为 0? 005-0. 05% ; 步骤三、发酵液分尚 发酵结束后，先将发酵液升温至60-80°C进行灭菌，然后降温至40°C，采用膜过滤处理 工艺，在0. 2-0. 5Mpa压力下进行分离获得发酵液中的菌丝体和蛋白以及发酵液清液，向分 离出的菌丝体和蛋白中加入絮凝剂絮凝，絮凝剂的加入量为分离出的菌丝体和蛋白质量的 5-20%，然后在0. 02-0. 04Mpa、20-40°C下经板框过滤得湿蛋白饲料，备用； 步骤四、发酵液清液离子交换 先将步骤三得到的发酵液清液的pH调节为3. 0-4. 0,然后加入到离子交换柱中吸附异 亮氨酸，当树脂吸附饱和时停止加入发酵液清液，用〇. 5-1. Omol/L的氨水溶液作为洗脱液 洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为清液，回收至发酵清液罐，备用；其次流出的 为pH值为2-10的异亮氨酸洗脱液，备用；最后流出的洗脱液为尾液，回洗脱罐重复使用，离 子交换过程为常温，压力为〇? 01-0.〇3Mpa ; 步骤五、脱氨塔脱氨 将步骤四收集的异亮氨酸洗脱液进入脱氨塔脱氨，得到脱氨液，备用； 步骤六、活性炭脱色 先将步骤五得到的脱氨液用浓硫酸调节pH为6. 0-7. 0,然后加入脱氨液中异亮氨酸总 量30%的活性炭，在60-70°C的条件下静置lh，再在0. 01-0. 02Mpa的压力下压滤除去活性 炭，得到脱色的异亮氨酸清液，备用； 步骤七、蒸发结晶 将步骤六得到的异亮氨酸清液加入到蒸发器中，在真空度为〇. 〇9Mpa、温度小于70°C 条件下，通入0. 5Mpa饱和蒸汽，进行蒸发浓缩，浓缩至异亮氨酸清液密度的10-12倍后，育 晶，离心分离除去母液，得到异亮氨酸晶体经过闪蒸干燥后进入包装工序，即完成异亮氨酸 的发酵生产。
[0005] 步骤一所述的二级种子培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖25_35g/L、硫 酸镁0.3-0. 8g/L、磷酸二氢钾1.0-2. Og/L、硫酸铵3-8g/L、酵母浸出粉1.5-3. Og/L、玉米 浆水解液 25-40g/L、生物素 0? 3-0. 8mg/L、Vbl 1. 5-3. Omg/L、消泡剂 0? 3mg/L，余量为水； 所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或 者为玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
[0006] 步骤二所述的发酵培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖100_200g/L、硫酸 镁0.3-0. 8g/L、磷酸二氢钾1.0-2. 0g/L、硫酸铵5-10g/L、酵母浸出粉1.5-3. 0g/L、玉米 浆水解液 15_35g/L、生物素 0.05-0. 25mg/L、Vbl 0.05-0. 2mg/L、柠檬酸钠 2-6g/L、消泡 齐[J 0? l-0.5mg/L，余量为水； 所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或 者为玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
[0007] 所述的二级种子培养基中的玉米浆水解液重量的60%直接配制在培养基中，剩余 的40%自动流加以调节发酵过程的pH。
[0008] 本发明的有益效果 本发明提供的异亮氨酸的发酵方法，发酵指标较好；异亮氨酸代谢产物产量明显提高， 平均产酸可以达到36. 9g/L，比改进前平均提高产酸率30% ;异亮氨酸代谢产物转化率提高 2-4%;产生菌体生长和代谢迅速，发酵周期缩短了 10h，设备周转率得到了提高，相应提高 了产量；减少了代谢副产物的生成，使发酵液中代谢产物的纯度相应提高，对产物的提取操 作和产品的纯度有利，同时降低了发酵成本和提取成本。
[0009] 本发明的发酵方法用培养基中玉米浆水解液总重量的40%代替传统工艺中用盐 酸调节pH的做法，避免了盐酸对不锈钢材质的罐体的腐蚀。另外该工艺中用生物素及VBi 作为生长因子，降低了料液的黏度，更加有利于菌体的呼吸代谢，同时有利于下游成品的提 取。
【具体实施方式】
[0010] 一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，步骤如下： 步骤一、培养菌种 把菌体划线接种于活化斜面，31°c恒温培养36-40h，在菌种室扩大培养生产一级种子， 然后将得到的一级种子接入二级种子罐中继续扩大培养，向二级种子培养基中通入无菌空 气，通气量为〇. 5V/V/M-0. 8V/V/M，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养，得到二 级种子培养液，备用； 步骤二、发酵 将二级种子培养液接入到装好发酵培养基的发酵罐中，二级种子培养液的体积为发酵 培养基体积的15%-20% ;通入无菌空气，连续发酵50-60h ;温度从开始发酵到发酵25h的过 程中控制为31-32°C，发酵25h后控制为32. 5-33°C;溶氧从开始发酵到发酵12h的过程中控 制为不低于18. 75mol/L，发酵12h后控制为11. 25-15. 62mol/L ;pH从开始发酵到发酵36h 的过程中控制为6. 8-7. 0,发酵36h后控制为7. 0-7. 2 ;发酵过程中控制残糖的质量百分数 为 0? 005-0. 05% ; 步骤三、发酵液分尚 发酵结束后，先将发酵液升温至60-80°C进行灭菌，然后降温至40°C，采用膜过滤处理 工艺，在0. 2-0. 5Mpa压力下进行分离获得发酵液中的菌丝体和蛋白以及发酵液清液，向分 离出的菌丝体和蛋白中加入絮凝剂絮凝，絮凝剂的加入量为分离出的菌丝体和蛋白质量的 5-20%，然后在0. 02-0. 04Mpa、20-40°C下经板框过滤得湿蛋白饲料，备用； 步骤四、发酵液清液离子交换 先将步骤三得到的发酵液清液的pH调节为3. 0-4. 0,然后加入到离子交换柱中吸附异 亮氨酸，当树脂吸附饱和时停止加入发酵液清液，用〇. 5-1. Omol/L的氨水溶液作为洗脱液 洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为清液，回收至发酵清液罐，备用；其次流出的 为pH值为2-10的异亮氨酸洗脱液，备用；最后流出的洗脱液为尾液，回洗脱罐重复使用，离 子交换过程为常温，压力为〇? 01-0. 〇3Mpa ; 步骤五、脱氨塔脱氨 将步骤四收集的异亮氨酸洗脱液进入脱氨塔脱氨，得到脱氨液，备用； 步骤六、活性炭脱色 先将步骤五得到的脱氨液用浓硫酸调节pH为6. 0-7. 0,然后加入脱氨液中异亮氨酸总 量30%的活性炭，在60-70°C的条件下静置lh，再在0. 01-0. 02Mpa的压力下压滤除去活性 炭，得到脱色的异亮氨酸清液，备用； 步骤七、蒸发结晶 将步骤六得到的异亮氨酸清液加入到蒸发器中，在真空度为〇. 〇9Mpa、温度小于70°C 条件下，通入0. 5Mpa饱和蒸汽，进行蒸发浓缩，浓缩至异亮氨酸清液密度的10-12倍后，育 晶，离心分离除去母液，得到异亮氨酸晶体经过闪蒸干燥后进入包装工序，即完成异亮氨酸 的发酵生产。
[0011] 步骤一所述的二级种子培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖25-35g/L、硫 酸镁0.3-0. 8g/L、磷酸二氢钾1.0-2. Og/L、硫酸铵3-8g/L、酵母浸出粉1.5-3. Og/L、玉米 浆水解液 25-40g/L、生物素 0? 3-0. 8mg/L、Vbl 1. 5-3. Omg/L、消泡剂 0? 3mg/L，余量为水； 所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或者为 玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
[0012] 步骤二所述的发酵培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖100_200g/L、硫酸 镁0.3-0. 8g/L、磷酸二氢钾1.0-2. Og/L、硫酸铵5-10g/L、酵母浸出粉1.5-3. Og/L、玉米 浆水解液 15_35g/L、生物素 0.05-0. 25mg/L、Vbl 0.05-0. 2mg/L、柠檬酸钠 2-6g/L、消泡 剂0. 1-0. 5mg/L，余量为水；所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓 缩所得的玉米浆原浆，或者为玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
[0013] 所述的二级种子培养基中的玉米浆水解液重量的60%直接配制在培养基中，剩余 的40%自动流加以调节发酵过程的pH。
[0014] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明： 实施例1: 一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，步骤如下： 步骤一、培养菌种 把菌体划线接种于活化斜面，31°c恒温培养36-40h，在菌种室扩大培养生产一级种子， 然后将得到的一级种子接入二级种子罐中继续扩大培养，向二级种子培养基中通入无菌 空气，通气量为0. 5V/V/M，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养，得到二级种子 培养液，备用；所述的二级种子培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖25g/L、硫酸镁 〇. 5g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、硫酸铵5g/L、酵母浸出粉2. 2g/L、玉米浆水解液33. 75g/L、 生物素〇. 3-0. 8mg/L、Vbl 1. 5-3. 0mg/L、消泡剂0. 3mg/L，余量为水；所述的玉米浆水解液 为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或者为玉米浆原浆再经浓硫 酸加热水解所得浆液。所述的玉米浆水解液中20. 25g/L作为底料配入培养基，13. 5g/L单 独灭菌在种子培养时自动流加作为酸溶液降低pH值。
[0015] 步骤二、发酵 将二级种子培养液接入到装好发酵培养基的发酵罐中，二级种子培养液的体积为发酵 培养基体积的15% ;通入无菌空气，连续发酵50-60h ;温度从开始发酵到发酵25h的过程中 控制为31-32°C，发酵25h后控制为32. 5-33°C ;溶氧从开始发酵到发酵12h的过程中控制 为不低于18. 75mol/L，发酵12h后控制为11. 25-15. 62mol/L ;pH才从开始发酵到发酵36h 的过程中控制为6. 8-7. 0,发酵36h后控制为7. 0-7. 2 ;发酵过程中控制残糖的质量百分数 为 0? 005-0. 05% ; 所述的发酵培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖120g/L、硫酸镁0.6g/L、磷 酸二氢钾1.2g/L、硫酸铵8.4g/L、酵母浸出粉2.4g/L、玉米浆水解液28.5g/L、生物素 0? 14mg/L、Vbl 0? lmg/L、柠檬酸钠4g/L、消泡剂0? 3mg/L，余量为水；所述的玉米浆水解液 为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或者为玉米浆原浆再经浓硫 酸加热水解所得浆液。
[0016] 步骤三、发酵液分离 发酵结束后，先将发酵液升温至60-80°C进行灭菌，然后降温至40°C，采用膜过滤处理 工艺，在0. 2-0. 5Mpa压力下进行分离获得发酵液中的菌丝体和蛋白以及发酵液清液，向分 离出的菌丝体和蛋白中加入絮凝剂絮凝，絮凝剂的加入量为分离出的菌丝体和蛋白质量的 5%，然后在0. 02-0. 04Mpa、20-40°C下经板框过滤得湿蛋白饲料，备用； 步骤四、发酵液清液离子交换 先将步骤三得到的发酵液清液的pH调节为3. 0,然后加入到离子交换柱中吸附异亮氨 酸，当树脂吸附饱和时停止加入发酵液清液，用0. 5mol/L的氨水溶液作为洗脱液洗脱树脂 吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为清液，回收至发酵清液罐，备用；其次流出的为pH值为 2-10的异亮氨酸洗脱液，备用；最后流出的洗脱液为尾液，回洗脱罐重复使用，离子交换过 程为常温，压力为〇? 01-0. 〇3Mpa ; 步骤五、脱氨塔脱氨 将步骤四收集的异亮氨酸洗脱液进入脱氨塔脱氨，得到脱氨液，备用； 步骤六、活性炭脱色 先将步骤五得到的脱氨液用浓硫酸调节pH为6. 5,然后加入脱氨液中异亮氨酸总量 30%的活性炭，在60-70°C的条件下静置lh，再在0. 01-0. 02Mpa的压力下压滤除去活性炭， 得到脱色的异亮氨酸清液，备用； 步骤七、蒸发结晶 将步骤六得到的异亮氨酸清液加入到蒸发器中，在真空度为〇. 〇9Mpa、温度小于70°C 条件下，通入0. 5Mpa饱和蒸汽，进行蒸发浓缩，浓缩至异亮氨酸清液密度的10-12倍后，育 晶，离心分离除去母液，得到异亮氨酸晶体经过闪蒸干燥后进入包装工序，即完成异亮氨酸 的发酵生产。
[0017] 发酵指标如表1所示： 表1:实施例1的发酵指标
【权利要求】
1. 一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：步骤如下： 步骤一、培养菌种 把菌体划线接种于活化斜面，31°C恒温培养36-40h，在菌种室扩大培养生产一级种子， 然后将得到的一级种子接入二级种子罐中继续扩大培养，向二级种子培养基中通入无菌 空气，通气量为0. 5V/V/M-0. 8V/V/M，二级种子在二级种子罐内经过实消、降温、培养，得到 二级种子培养液，备用； 步骤二、发酵 将二级种子培养液接入到装好发酵培养基的发酵罐中，二级种子培养液的体积为发酵 培养基体积的15%-20% ;通入无菌空气，连续发酵50-60h ;温度从开始发酵到发酵25h的过 程中控制为31-32°C，发酵25h后控制为32. 5-33°C;溶氧从开始发酵到发酵12h的过程中控 制为不低于18. 75mol/L，发酵12h后控制为11. 25-15. 62mol/L ;pH从开始发酵到发酵36h 的过程中控制为6. 8-7. 0,发酵36h后控制为7. 0-7. 2 ;发酵过程中控制残糖的质量百分数 为 0? 005-0. 05% ; 步骤三、发酵液分尚 发酵结束后，先将发酵液升温至60-80°C进行灭菌，然后降温至40°C，采用膜过滤处理 工艺，在0. 2-0. 5Mpa压力下进行分离获得发酵液中的菌丝体和蛋白以及发酵液清液，向分 离出的菌丝体和蛋白中加入絮凝剂絮凝，絮凝剂的加入量为分离出的菌丝体和蛋白质量的 5-20%，然后在0. 02-0. 04Mpa、20-40°C下经板框过滤得湿蛋白饲料，备用； 步骤四、发酵液清液离子交换 先将步骤三得到的发酵液清液的pH调节为3. 0-4. 0,然后加入到离子交换柱中吸附异 亮氨酸，当树脂吸附饱和时停止加入发酵液清液，用〇. 5-1. Omol/L的氨水溶液作为洗脱液 洗脱树脂吸附的异亮氨酸，洗脱时先流出的为清液，回收至发酵清液罐，备用；其次流出的 为pH值为2-10的异亮氨酸洗脱液，备用；最后流出的洗脱液为尾液，回洗脱罐重复使用，离 子交换过程为常温，压力为〇? 01-0. 〇3Mpa ; 步骤五、脱氨塔脱氨 将步骤四收集的异亮氨酸洗脱液进入脱氨塔脱氨，得到脱氨液，备用； 步骤六、活性炭脱色 先将步骤五得到的脱氨液用浓硫酸调节pH为6. 0-7. 0,然后加入脱氨液中异亮氨酸总 量30%的活性炭，在60-70°C的条件下静置lh，再在0. 01-0. 02Mpa的压力下压滤除去活性 炭，得到脱色的异亮氨酸清液，备用； 步骤七、蒸发结晶 将步骤六得到的异亮氨酸清液加入到蒸发器中，在真空度为〇. 〇9Mpa、温度小于70°C 条件下，通入0. 5Mpa饱和蒸汽，进行蒸发浓缩，浓缩至异亮氨酸清液密度的10-12倍后，育 晶，离心分离除去母液，得到异亮氨酸晶体经过闪蒸干燥后进入包装工序，即完成异亮氨酸 的发酵生产。
2. 如权利要求1所述的一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：步骤一所述 的二级种子培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖25-35g/L、硫酸镁0. 3-0.8g/L、磷 酸二氢钾1.0-2. Og/L、硫酸铵3-8g/L、酵母浸出粉1.5-3. Og/L、玉米浆水解液25-40g/L、 生物素 〇? 3-0. 8mg/L、Vbl 1. 5-3. Omg/L、消泡剂 0? 3mg/L，余量为水； 所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或 者为玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
3. 如权利要求1所述的一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：步骤二所述 的发酵培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖100_200g/L、硫酸镁0.3-0. 8g/L、磷酸 二氢钾1.0-2. Og/L、硫酸铵5-10g/L、酵母浸出粉1.5-3. Og/L、玉米浆水解液15-35g/L、 生物素 0.05-0. 25mg/L、Vbl 0.05-0. 2mg/L、柠檬酸钠 2-6g/L、消泡剂 0.1-0. 5mg/L，余量 为水； 所述的玉米浆水解液为玉米经亚硫酸浸泡后的浸泡液蒸发浓缩所得的玉米浆原浆，或 者为玉米浆原浆再经浓硫酸加热水解所得浆液。
4. 如权利要求2所述的一种提高异亮氨酸产量的发酵方法，其特征在于：所述的二级 种子培养基中的玉米浆水解液重量的60%直接配制在培养基中，剩余的40%自动流加以调 节发酵过程的pH。
【文档编号】C12P13/06GK104450815SQ201410666493
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】李静, 刘帅, 刘晓都 申请人:河南巨龙生物工程股份有限公司