用于检测施马伦贝格病毒的荧光rt-pcr引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂盒。所述引物与探针的序列如SEQ ID NO.1～6所示。所述试剂盒中含有引物、探针、反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照。本发明建立的施马伦贝格病毒荧光RT-PCR试剂盒及检测方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，是施马伦贝格病毒快速检测的良好方法。
【专利说明】用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物、探针及试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光 RT-PCR引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 施马伦贝格病（Schmallenberg，SB)是2011年11月在德国北莱茵-威斯特法伦 州施马伦贝格镇牛羊中发现的一种新的病毒性动物传染病，该病的主要临床特征是：受感 染母羊流产、死胎，新生羔羊畸形、成活率下降，感染牛表现为腹泻、发热、产奶量下降等，对 畜牧业造成了较大危害。
[0003] 目前SB的实验室诊断方法主要包括细胞培养分离病毒等病原检测方法，以及酶 联免疫吸附试验（ELISA)、间接免疫荧光试验（IFA)和中和试验（NT)等血清学方法。病毒分 离通常是确诊疫病的金标准，但由于成年患病动物常不表现临床症状，难以掌握病毒血症 的具体时期，且费时费力，因此病毒分离的实施受到一定的限制，不适应快速检测的需要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物组及试 剂盒。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供上述荧光RT-PCR引物组及试剂盒在检测施马伦贝 格病毒上的应用。
[0006] 本发明所采取的技术方案是： 用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述引物是根据施马伦贝格病 毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。其核苷酸序列如下所示： 60F :5' - GCTTGCCTGGGCCAAAT -3'（SEQ ID NO. 1)， 60R:5' - CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3' （SEQ ID N0.2)， 60P :Fam-5' - TGGATTCTCTCCTGCTGC -3' -Eclipse (SEQ ID NO. 3); 一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其含有以上所述的引物和探针， 还含有反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝格病毒阳性对照 和阴性对照。
[0007] 所述施马伦贝格病毒阳性对照为施马伦贝格病毒CDNA的质粒，所述阴性对照为 无菌采取澳洲进口牛血清，经检测BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV为阴性。
[0008] 以上所述的试剂盒在施马伦贝格病毒检测中的应用。
[0009] 本发明的有益效果是： 本发明建立的施马伦贝格病毒荧光RT-PCR试剂盒及检测方法具有特异、敏感、重复性 好、快速、费用低廉，是施马伦贝格病毒快速检测的良好方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1为RT-PCR电泳结果图（M :DNA Marker DL-2000 ;P :阳性对照；1 :引物60扩增 pMD-SBV ;N:阴性对照）； 图2为SBV荧光RT-P CR检测结果； 图3为SBV荧光RT-PCR特异性试验； 图4为阳性质粒稀释敏感性试验； 图5为SBV荧光RT-PCR标准曲线图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0012] 实施例1引物设计 从Genebank下载多个施马伦贝格病毒（SBV)的核衣壳蛋白基因序列，用DNASTAR 5. 07 软件进行比对，寻找高度保守的区域，然后选取适当的核衣壳蛋白基因序列分别设计2套 特异性检测SBV核衣壳蛋白基因的引物、Taqman探针，送大连宝生物技术有限公司合成， 用DEPC处理水溶解，-80°C避光保存。引物、探针见表1 : 表I SBV荧光RT-PCR引物、探针
【权利要求】
1. 用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述引物是根据 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。
2. 根据权利要求1所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征 在于，其核苷酸序列如下所示： 60F :5' - GCTTGCCTGGGCCAAAT -3'（SEQ ID NO. 1)， 60R：5, - CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3, (SEQ ID NO. 2), 60P :Fam-5, - TGGATTCTCTCCTGCTGC -3, -Eclipse (SEQ ID N0.3)。
3. -种用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其含有权利要求1或2所述的 引物和探针。
4. 根据权利要求3所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒中还含有反转录酶、DNA聚合酶、RNA提取试剂、荧光PCR反应试剂、施马伦贝 格病毒阳性对照和阴性对照。
5. 根据权利要求4所述的用于检测施马伦贝格病毒的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在 于，所述施马伦贝格病毒阳性对照为施马伦贝格病毒cDNA的质粒，所述阴性对照为无菌采 取澳洲进口牛血清，经检测BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV为阴性。
6. 权利要求3?5任一项所述的试剂盒在施马伦贝格病毒检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK104450959SQ201410680100
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】杨素, 陶旻, 陈轩, 黄海超, 徐海聂, 沙才华, 廖秀云, 罗宝正, 薄清如 申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局