一种体外酶反应生成1,2,4-丁三醇的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种体外酶反应生成1,2,4-丁三醇的方法及应用，属于生物工程【技术领域】。本发明所提供的方法是分别构建过表达D-木糖酸脱水酶基因、2-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的基因工程菌，发酵培养所得基因工程菌后，再利用超声波破碎菌体，收集粗酶液，混合调整D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶浓度后，加入反应底物后合成1,2,4-丁三醇。本发明所提供的方法实现了在体外通过控制酶反应以D-木糖酸为原料合成1,2,4-丁三醇，具有便于扩大生产的特点，扩大后产量可达到5.98g/L。
【专利说明】一种体外酶反应生成1,2,4- 丁三醇的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体外酶反应生成1，2，4- 丁三醇的方法及应用，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]1，2，4-丁三醇(BT)是一种无色、无臭、透明的水溶性粘稠糖浆状多元醇，其主要用作有机合成的化学中间体，广泛应用于军工、医药、烟草、化妆品、造纸、农业和高分子材料领域。其硝基化合物1，2，4-丁三醇三硝酸酯是具有民用和军用潜力的高能塑化剂，它可以代替硝化甘油作为高能、高新配方推进剂。BT在医药上，可作缓释剂，控制药物的释放速度，是用于合成抗病毒化合物、血小板活性因子等多种药物制备的关键中间体。在高分子材料领域，可用作高分子材料的交联剂；另外BT还可用作高级墨水的防干剂、高级服装的表面处理剂、陶瓷加工助剂、特殊用途包装与储运等。
[0003]目前，1，2，4-丁三醇利用酯化的D，L_苹果酸(如苹果酸二甲酯)在NaBH4的作用下，于C2_6醇和四氢呋喃的混合物中进行高压催化氢化反应来实现商业化生产。然而，这种途径中约25%的原料用于副产物的产生，这不仅限制了丁三醇的产量而且增加了分离提纯的难度。此外，化学合成法存在反应条件苛刻、污染物排放严重等诸多缺点，部分研宄者将目光转向更为经济和环保的生物合成技术。
[0004]Niu等人首次实现了双微生物工艺法合成丁三醇(Niu ff, Molefe MN，FrostJ:Microbial synthesis of the energetic material precursor 1，2，4-butanetr1l.Journal of the American Chemical Society 2003, 125:12998-12999) 0 在这个过程具体为:D-木糖在假单胞菌的作用下转化成D-木糖酸，产率70% (mol/mol)，再由大肠埃希氏菌DH5a/pWN6.186A催化D-木糖酸转化成D_l，2，4_ 丁三醇，产率25% (moI/mol) ；L-阿拉伯糖在P.fragi的氧化下转化成L-阿拉伯_1，4-内醋和L-阿拉伯糖酸的混合物，总产率54% (mol/mol)，内酯水解后，L-阿拉伯糖酸采用E.coli BL21(DE3)/pffN6.222k转化生成L-1，2，4- 丁三醇，产率35 % (mol/mol)。Liu等构建了一株工程大肠杆菌实现了利用单一宿主菌从D-木糖到1，2，4- 丁三醇的生产(ValdehuesaKNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee ff-K, Chung ff-J:Direct b1convers1nof d-xylose to I,2,4-butanetr1l in an engineered Escherichia col1.ProcessB1chemistry2014, 49:25-32)。通过摇瓶发酵培养48h后，丁三醇产量达到0.88g/l，摩尔产率是12.82%。虽然微生物法合成丁三醇已有报道，但由于微生物代谢的复杂性，体内合成不易调控，丁三醇的产量、产率等指标等过低，难以进行工程化放大。而体外酶反应法具有可调控、专一性强等优点，在重要化学品合成领域中具有广泛的实用潜力。实际上，酶法反应已应用于药物、食品添加剂等精细化学品的生产合成[张震元，氨基酸的酶法合成，食品与发酵工业 1985，02 ;Gross RA, Kumar A, Kalra B:Polymer synthesis by in vitroenzyme catalysis.Chemical Reviews 2001, 101:2097-2124.] o 通过非细胞的体外反应，可以在体外研宄最佳的反应体系。通过精确控制各酶的含量及添加相关的辅助因子，找出整个代谢途径中的关键因素，寻找关键步骤，确定关键酶，为细胞内代谢途径优化提供参考依据。通过体外反应找到限制性酶，也可以对其进行改造从而提高终产物量。目前，尚未有报道以D-木糖酸为底物，利用体外酶催化合成1，2，4- 丁三醇的相关报道。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种体外酶反应生成1，2，4- 丁三醇的方法，所采取的技术方案如下:
[0006]本发明的目的在于提供一种体外酶反应生成1，2，4- 丁三醇的方法，该方法是分别构建过表达D-木糖酸脱水酶基因、2-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的基因工程菌，发酵培养所得基因工程菌后，再利用超声波破碎菌体，收集粗酶液，混合调整D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶浓度后，加入反应底物后合成1，2，4- 丁三醇。
[0007]所述方法的步骤如下:
[0008]I)分别将D-木糖酸脱水酶基因yjhG、2-酮酸脱羧酶基因mdlC和醇脱氢酶基因adhP导入到宿主菌中获得三种基因工程菌；
[0009]2)培养步骤2)所得的三种基因工程菌，分别过表达D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶；
[0010]3)利用超声波破碎步骤2)所培养的基因工程菌，收集粗酶液；
[0011]4)混合步骤3)所得的粗酶液，调整D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度，加入反应底物后，合成1，2，4-丁三醇。
[0012]步骤I)所述基因可不做具体限定，只要任何基因合成的蛋白质具有所述功能即可。但是，优选，D-木糖酸脱水酶基因yjhG，GenBank登录号为12931979 ;所述2-酮酸脱羧酶基因mdlC，GeneBank登录号AAC15502.1 ;所述醇脱氢酶基因adhP，GeneBank登录号为946036 ;所述宿主菌，为大肠杆菌。
[0013]步骤2)所述培养基因工程菌，是将已构建的基因工程菌接种到100ml LB培养基中，摇床370C 180rpm培养至OD600为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol.厂1，20°C培养12-18h，4°C 4200rpm离心5min收集菌体，最后用5ml pH7.0Hepes缓冲液洗涤两次。
[0014]步骤3)所述超声波破碎，是在22kHz，150W的条件下处理30min，破碎后在4°C，15000rpm离心lOmin，收集上清，获得粗酶液。
[0015]步骤4)所述调整D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度，是将D-木糖酸脱水酶的浓度调整为0.39-0.5mg/ml，2-酮酸脱羧酶的浓度调整为0.05-0.5mg/ml，醇脱氢酶的浓度调整为0.39mg/mlo
[0016]步骤4)所述加入反应底物，是使最终反应体系为:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP ;所述合成 1，2，4-丁三醇，合成条件为:反应温度30°C，反应时间12-24h。
[0017]所述方法的具体步骤为:
[0018]I)分别将D-木糖酸脱水酶基因yjhG、2-酮酸脱羧酶基因mdlC和醇脱氢酶基因adhP构建入大肠杆菌表达质粒载体pET-30a中，获得重组质粒，再将重组质粒导入到大肠杆菌中获得三种大肠杆菌基因工程菌；
[0019]所述D-木糖酸脱水酶基因yjhG，GenBank登录号为12931979 ;所述2-酮酸脱羧酶基因mdlC，GeneBank登录号AAC15502.1 ;所述醇脱氢酶基因adhP，GeneBank登录号为946036 ；
[0020]2)将步骤I)所得的大肠杆菌基因工程菌接种到100ml LB培养基中，摇床370C 180rpm培养至006(|(|为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol培养12_18h，4°C 4200rpm离心5min收集菌体，最后用5ml pH7.0Hepes缓冲液洗涤两次；
[0021]3)收集步骤2)所得的大肠杆菌基因工程菌菌体，利用!fepes缓冲液重新悬浮后再利用超声波进行破碎处理，破碎是在22kHz，150W的条件下处理30min，破碎后在4°C，15000rpm离心lOmin，收集上清，获得粗酶液；
[0022]4)混合步骤3)所得的粗酶液，将D-木糖酸脱水酶的浓度调整为0.5mg/ml，2-酮酸脱羧酶的浓度调整为0.5mg/ml,醇脱氢酶的浓度调整为0.39mg/ml,加入反应底物至最终体系为 50mM Hepes buffer pH7.0, 1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH，0.375mM ThDP，在 30°C 下，反应 24h。
[0023]所述方法用于生产1，2，4- 丁三醇。
[0024]本发明获得的有益效果如下:
[0025]1.本发明构建的方法实现了在体外利用酶反应以D-木糖酸为原料合成1，2，4-丁三醇；
[0026]2.利用本发明方法，精确调控各酶的用量，提高了体外合成1，2，4- 丁三醇能力；
[0027]3.找到1，2，4-丁三醇合成途径中的关键酶，可以对其进行改造，提高其活性，从而提尚广物量；
[0028]4.构建一个可控的调控体系，控制1，2，4-丁三醇的合成，同时为细胞内的异1，2，4- 丁三醇合成代谢调控提供依据；
[0029]5.体外反应可以缩短生产周期，本发明仅需12_24h即可获得产物，如果用传统微生物发酵最少需要48-72h。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为1，2，4- 丁三醇合成途径中3种酶的SDS-PAGE检测图；
[0031 ] (M，marker ;I，为 yjhD 粗酶液；2，为 mdlC 粗酶液；3，为 adhP 粗酶液)。
[0032]图2为1，2，4-丁三醇液相图谱。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0034]以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，均可从商业渠道获得。
[0035]以下实施例中所用的D-木糖酸脱水酶是来自大肠杆菌的基因，2-酮酸脱羧酶是来自Pseudomonas putida的基因，醇脱氢酶是来自大肠杆菌的基因。将各基因分别连接到pET-30a(+)表达载体上，转化至大肠杆菌BL21 (DE3);得到的阳性克隆培养至OD_为0.6-1.0，加 IPTG 终浓度为 0.5mmol.1^，20°〇培养 12_18h 获得。
[0036]实施例1
[0037]I, 2，4- 丁三醇合成代谢相关酶的粗酶液制备，其具体步骤如下:
[0038](I)利用yjhG基因5’端和3’端引物引入酶切位点(NcoI和EcoRI)，对yjhG基因和pET-30a(+)进行双酶切，然后将yjhG基因连接到pET_30a(+)载体上；
[0039](2)利用mdlC基因5’端和3’端引物引入酶切位点(NcoI和EcoRI)，对mdlC基因和pET-30a(+)进行双酶切，然后将mdlC基因连接到pET-30a(+)载体上；
[0040](3)利用adhP基因5’端和3’端引物引入酶切位点(NcoI和EcoRI)，对adhP基因和pET-30a(+)进行双酶切，然后将adhP基因连接到pET_30a(+)载体上；
[0041](4)将步骤(I)、⑵、(3)构建的相应的三个重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，得到阳性克隆进行培养；
[0042](5)以构建的重组大肠杆菌接种于10ml LB培养基中，摇床37 °C 180rpm培养至OD600为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol培养12-18小时，4°C 4200rpm离心5min收集菌体，用5ml pH7.0Hepes缓冲液洗涤两次，超声波破碎:22kHz, 150W, 30分钟。破碎液后4°C，15000rpm离心lOmin，收集上清，即为粗酶液。粗酶液进行SDS-PAGE检测，如图1所示。
[0043]实施例2
[0044]I, 2，4- 丁三醇合成代谢相关酶的体外反应，其具体步骤如下:
[0045](I)分别取10ml表达上述三个酶的大肠杆菌培养液4200rpm, 4°C离心5min，弃上清液，用50mM pH 7.0Hepesbuffer洗涤两次，最后使用5ml Hepesbuffer重悬；然后用超声破碎仪破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C离心lOmin，将上清与沉淀分离，保留上清液，加入10%甘油，按试剂盒方法测定蛋白含量。
[0046](2)步骤(I)制得的D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶加入反应体系，保持D-木糖酸脱水酶浓度为0.39mg/ml，2-酮酸脱羧酶浓度为0.05mg/ml，醇脱氢酶浓度为0.39mg/ml，并加入其它反应物质，最终体系为:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mM ThDP。
[0047](3)将步骤(2)混合液用水补足体系为400 μ 1，30°C反应24h。高效液相色谱检测1，2，4- 丁三醇，如图2所示，其产量为42.84mg/l。
[0048]实施例3
[0049]中间水平1，2，4- 丁三醇体外合成，其具体步骤如下:
[0050](I)分别取10ml表达上述三个酶的大肠杆菌培养液4200rpm，4°C离心5min，弃上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗涤两次，最后使用5ml Hepes buffer重悬；然后用超声破碎仪破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C离心lOmin，将上清与沉淀分离，保留上清液，加入10%甘油，按试剂盒方法测定蛋白含量。
[0051](2)步骤(I)制得的D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶加入反应体系，保持D-木糖酸脱水酶浓度为0.39mg/ml，2-酮酸脱羧酶浓度为0.5mg/ml，醇脱氢酶浓度为0.39mg/ml，并加入其它反应物质，最终反应体系为:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mM ThDP。
[0052](3)将步骤(2)混合液用水补足体系为400 μ 1，30°C反应24h。高效液相色谱检测1，2，4-丁三醇，其产量为153.lmg/lo
[0053]实施例4
[0054]高水平1，2，4- 丁三醇体外合成，其具体步骤如下:
[0055](I)分别取10ml表达上述三个酶的大肠杆菌培养液4200rpm，4°C离心5min，弃上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗涤两次，最后使用5ml Hepes buffer重悬；然后用超声破碎仪破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C离心lOmin，将上清与沉淀分离，保留上清液，加入10%甘油，按试剂盒方法测定蛋白含量。
[0056](2)步骤(I)制得的D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶加入反应体系，保持D-木糖酸脱水酶浓度为0.5mg/ml，2-酮酸脱羧酶浓度为0.5mg/ml，醇脱氢酶浓度为0.39mg/ml，并加入相应的反应物质。最终反应体系为:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mMD-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP。
[0057](3)将步骤(2)混合液用水补足体系为400 μ 1，30°C反应24h。高效液相色谱检测1，2，4- 丁三醇，其产量为 239.25mg/l。
[0058]实施例5
[0059]放大水平1，2，4- 丁三醇体外合成，其具体步骤如下:
[0060](I)分别取10ml表达上述三个酶的大肠杆菌培养液4200rpm，4°C离心5min，弃上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗涤两次，最后使用5ml Hepes buffer重悬；然后用超声破碎仪破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C离心lOmin，将上清与沉淀分离，保留上清液，加入10%甘油，按试剂盒方法测定蛋白含量。
[0061](2)步骤(I)制得的D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶加入反应体系，保持D-木糖酸脱水酶浓度为0.5mg/ml，2-酮酸脱羧酶浓度为0.5mg/ml，醇脱氢酶浓度为0.39mg/ml，并加入相应的反应物质。最终反应体系为:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mMD-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP。
[0062](3)按实施例4的1，2，4-丁三醇合成反应各底物的浓度比例，以水为补充剂，将步骤(2)混合液配制成的反应体系按上述比例扩大到100ml，再于30°C下反应24h。高效液相色谱检测1，2，4- 丁三醇，其产量为5.98g/Lo
[0063]虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种体外酶反应生成1，2，4-丁三醇的方法，其特征在于，是分别构建过表达D-木糖酸脱水酶基因、2-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的基因工程菌，发酵培养所得基因工程菌后，再利用超声波破碎菌体，获得粗酶液，混合并调整混合液中D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶浓度后，加入反应底物合成1，2，4- 丁三醇。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)分别将D-木糖酸脱水酶基因yjhG、2-酮酸脱羧酶基因mdlC和醇脱氢酶基因adhP导入到宿主菌中获得三种基因工程菌； 2)发酵培养步骤2)所得的三种基因工程菌，分别过表达D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶； 3)利用超声波破碎步骤2)所培养的基因工程菌，收集粗酶液； 4)混合步骤3)所得的粗酶液，调整混合液中D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度，加入反应底物后，合成1，2，4-丁三醇。
3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤I)所述D-木糖酸脱水酶基因yjhG，GenBank登录号为12931979 ;所述2-酮酸脱羧酶基因mdlC，GeneBank登录号AAC15502.1 ;所述醇脱氢酶基因adhP，GeneBank登录号为946036。
4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤I)所述宿主菌，为大肠杆菌。
5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述培养基因工程菌，是将已构建的基因工程菌接种到100ml LB培养基中，摇床37°C 180rpm培养至OD6tltl为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol.?Λ20?培养12_18h，4°C下4200rpm离心5min收集菌体，最后用5ml pH7.0Hepes缓冲液洗涤两次。
6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述超声波破碎，是在22kHz，150W的条件下处理30min，破碎后在4°C，15000rpm离心lOmin，收集上清，获得粗酶液。
7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述调整混合液中D-木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度，是将D-木糖酸脱水酶的浓度调整为0.39-0.5mg/ml,2-酮酸脱羧酶的浓度调整为0.05-0.5mg/ml，醇脱氢酶的浓度调整为0.39mg/ml。
8.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述加入反应底物，是使最终反应体系浓度为:50mM Hepes buffer pH7.0，1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mMThDP ;所述合成1，2，4- 丁三醇，合成条件为:反应温度30°C，反应时间12-24h。
9.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为: 1)分别将D-木糖酸脱水酶基因yjhG、2-酮酸脱羧酶基因mdlC和醇脱氢酶基因adhP构建入大肠杆菌表达质粒载体pET-30a中，获得重组质粒，再将重组质粒导入到大肠杆菌中获得三种大肠杆菌基因工程菌； 所述D-木糖酸脱水酶基因yjhG，GenBank登录号为12931979 ;所述2_酮酸脱羧酶基因mdlC，GeneBank登录号AAC15502.1 ;所述醇脱氢酶基因adhP，GeneBank登录号为946036 ； 2)将步骤I)所得的大肠杆菌基因工程菌接种到10mlLB培养基中，摇床37°C180rpm培养至OD6tltl为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol.L-1JOO培养12_18h，4°C 4200rpm离心5min收集菌体，最后用5mlpH7.0Hepes缓冲液洗涤两次； 3)收集步骤2)所得的大肠杆菌基因工程菌菌体，利用H印es缓冲液重新悬浮后再利用超声波进行破碎处理，破碎是在22kHz，150W的条件下处理30min，破碎后在4°C，15000rpm离心lOmin，收集上清，获得粗酶液； 4)混合步骤3)所得的粗酶液，将D-木糖酸脱水酶的浓度调整为0.5mg/ml，2-酮酸脱羧酶的浓度调整为0.5mg/ml，醇脱氢酶的浓度调整为0.39mg/ml，加入反应底物至最终体系为 50mM Hepes buffer pH7.0, 1mM D-木糖酸钾，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mMThDP ;最后在30 °C下，反应24h。
10.权利要求1-9所述方法，其特征在于，用于生产1，2，4- 丁三醇。
【文档编号】C12P7/18GK104450798SQ201410682463
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】咸漠, 蒋昱东, 刘炜, 曹玉锦 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所