检测苹果茎沟病毒或李属坏死环斑病毒的特异性引物、探针及基因芯片的制作方法

检测苹果茎沟病毒或李属坏死环斑病毒的特异性引物、探针及基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测苹果茎沟病毒和李属坏死环斑病毒的特异性引物、探针及基因芯片。用于检测苹果茎沟病毒的特异性引物对的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。用于检测李属坏死环斑病毒的特异性引物对的核苷酸序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。本发明结合RT-PCR检测，用所述探针所制备的两种病毒的基因芯片检测进行了试验，结果显示特异性好、敏感性强、重现性稳定、操作时间短、简单，可广泛应用于苹果茎沟病毒和李属坏死环斑病毒引起的植物病毒病的早期诊断、防治。
【专利说明】检测苹果茎沟病毒或李属坏死环斑病毒的特异性引物、探 针及基因芯片

【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测植物病毒的引物、探针W及用它们制备的基因检测芯片，尤其涉 及检测苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV)和李属坏死环斑病毒（Primus necrotic ringspot virus, PNRSV)的特异引物和探针W及用它们制备的基因芯片，属于苹 果茎沟病毒和李属坏死环斑病毒的分子检测领域。

【背景技术】
[0002] 苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV)是苹果和梨上发生普遍的潜 隐病毒之一，已报道该病毒的自然寄主除苹果和梨外，还可危害禮桃、杏、巧橘等果树和百 合。李属坏死环斑病毒（Primus necrotic ringspot virus,PNRSV)是一种在世界范围内分 布的病毒，该病毒寄主范围广，可侵染桃、杏、禮桃等李属和月季、苹果等醫薇属植物。PNRSV 是中国的二类进境检疫性有害生物，对北方的果树栽培是一个严重的威胁。目前，检测该 两种病毒的方法主要有酶联免疫吸附测定、电镜技术和RT-PCR。该些技术在实际应用上有 的方法提纯过程繁琐，耗时长，有的操作繁琐，易于造成污染，出现假阳性。而近几年发 展起来的基因芯片技术具有集成化和高通量等优点，并在基因表达分析、微生物鉴定、单核 巧酸多态性检测等方面获得广泛的应用。基因芯片是将大量已知序列的核酸片段按设计好 的排列方式固化于支持物表面，制成芯片。检测样品经英光标记物PCR扩增后，与探针充分 杂交，洗脱后扫描，用图像显示杂交结果。该技术已经在人体、动植物病毒，转基因植物检测 方面有应用。


【发明内容】

[0003] 本发明的目的之一是提供用于检测苹果茎沟病毒的一对特异性引物和一条探 针；
[0004] 本发明的目的之二是将用于检测苹果茎沟病毒的一对特异性引物和一条探针制 备成检测苹果茎沟病毒的基因芯片；
[0005] 本发明的目的之H是提供用于检测李属坏死环斑病毒的一对特异性引物和一条 探针；
[0006] 本发明的目的之四是将用于检测李属坏死环斑病毒的一对特异性引物和一条探 针制备成检测苹果茎沟病毒的基因芯片；
[0007] 本发明的上述目的是通过W下技术方案来实现的：
[0008] 本发明提供了用于检测苹果茎沟病毒的一对特异性引物和一条探针；其中，所述 的一对特异性引物的核巧酸序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述的探针的 核巧酸序列为SEQ ID No. 3所示。
[0009] 可W采用本领域的常规方式，应用所述的检测苹果茎沟病毒的探针制备成检测苹 果茎沟病毒的生物芯片，例如：基因芯片、组织芯片或细胞芯片等；作为本发明，优选为基 因芯片。基因芯片是在载体（尼龙膜、玻璃片或娃片等）上按照预先设计的位置高密度有 序的排列大批量的核酸探针（也称DNA芯片或DNA微阵列），形成高密度点阵。
[0010] 用所述的特异性引物扩增样品的DNA后，通过分子杂交技术在相同条件下与芯片 上的探针分子进行杂交，采用同位素法、化学英光法或化学发光法等方法对反应结果进行 显示，还可W采用相应的方法进行定量。
[0011] 具体到本发明，可W将SEQ ID No. 3所示的探针采用原位点样法或直接点样法等 方式将探针按照预先设计的位置高密度有序的排列或点样到尼龙膜载体上，得到基因芯 片；从待检测的植物样品中提取RNA经过逆转录后再用SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的特异性引物（其中SEQ ID No. 2所示的特异性引物用切3标记）进行PCR扩增，将扩增产 物与芯片上的探针分子进行分子杂交，根据英光信号判断样品中是否含有苹果茎沟病毒。
[0012] 本发明还提供了用于检测李属坏死环斑病毒的一对特异性引物和一条探针；其 中，所述的一对特异性引物的核巧酸序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的 探针的核巧酸序列为SEQ ID No. 6所示。
[0013] 同样的，可W采用本领域的常规方式，应用所述的检测苹果茎沟病毒的探针制备 成检测李属坏死环斑病毒的生物芯片，例如：基因芯片、组织芯片或细胞芯片等；作为本发 明，优选为基因芯片。具体到本发明，可W将SEQ ID No. 6所示的探针采用原位点样法或 直接点样法等方式将探针按照预先设计的位置高密度有序的排列或点样到尼龙膜载体上， 得到基因芯片；从待检测的植物样品中提取RNA经过逆转录后再用SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的特异性引物（其中SEQ ID No. 5所示的特异性引物用切3标记）进行PCR扩增， 将扩增产物与芯片上的探针分子进行分子杂交，根据英光信号判断样品中是否含有李属坏 死环斑病毒。
[0014] 用于制备基因芯片的方法W及采用所制备的基因芯片检测苹果茎沟病毒的方法， 为本领域技术人员所习知。
[0015] 本发明分别用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 6所示的寡核巧酸制备成基因芯片，用 切3标记反义引物，不对称PCR扩增产物与寡核巧酸探针杂交，扫描并进行结果分析。试验 结果表明，多次杂交，PNRSV和ASGV均产生较强的阳性信号，10种阴性病毒均无信号产生。 其对质粒的检测灵敏度可达1〇 3拷贝数。证明基因芯片技术具有很好的稳定性、特异性和 局灵敏度。
[001引本发明结合RT-PCR检测，对ASGV和PNRSV两种病毒的基因芯片检测进行了探索， 结果显示该技术特异性好、敏感性强、重现性稳定、操作时间短、简单，可广泛应用于苹果茎 沟病毒和李属坏死环斑病毒引起的植物病毒病的早期诊断、防治。本发明为果树病毒早期 监测、组培脱毒、抗病毒育种等工作的顺利开展提供了切实可行的技术依巧。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1ASGV和PNRSV的RT-PCR检测结果；1.感染PNRSV的禮桃叶，3.感染ASGV的 苹果叶，2, 4.对照叶。
[001引图2芯片检测PNRSV和ASGV的杂交结果；1. PNRSV ;2. ASGV ;3.左边的信号是 PNRSV,右边信号是 ASGV ;4. negative samples ;5.空白对照。
[0019] 图3芯片检测PNRSV和ASGV的灵敏度试验杂交结果；1，2, 3,4分别表示质粒模板 为1〇5,1〇4,1〇3,1〇2拷贝的PNRSV和ASGV ;5为阴性对照。

【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但该些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但该些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[00川 实施例
[002引 1试验材料和方法
[0023] 1. 1试验材料
[0024] 苹果茎沟病毒ASGV侵染的苹果叶片阳性样品由中国检验检疫科学研究院动植物 检疫研究所提供。PNRSV侵染的禮桃叶片由河北省农林科学院昌黎果树研究所提供。阴性样 品为黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV)、马铃墓靑顶病毒（PMTV)、马铃墓黄矮病毒（PYDV)、蚕豆 萎慧病毒炬BWV)、玉米粗缩病毒（MRDV)、水稻条纹病毒巧SV)、辣椒轻型斑驳病毒（PMMoV)、 芋花叶病毒值sMV)、番茄花叶病毒（ToMV)、木穫權绿环斑病毒（HCRSV)，由中国农业科学院 植物保护研究所、中国农业大学、浙江农业科学研究院、河北省唐海县植保站提供。
[00巧]1. 2试验方法
[002引 （1)引物与探针的设计与合成。根据ASGV和PNRSVCP基因保守序列，用Primer软 件设计特异引物，扩增片段长度分别为414bp和34化P。同时根据ASGV和PNRSV CP基因及 阴性对照大鼠基因用DNASIS软件设计各基因的探针序列，经GenBank序列同源性比较，得 到ASGV和PNRSV CP基因特异的寡核巧酸探针序列。
[0027] ASGV 正义引物：5' _ AAAACCTTTGCTGCCACTTC _ 3'
[0028] ASGV 反义引物；5' _ TTTCACACGACTCCTAACCC _ 3'
[0029] ASGV 探针；5' _ CCAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGTACG _ 3'。
[0030] PNRSV 正义引物；5' _ AACAGAGGGCTGCGAATAAC _ 3'
[00引]PNRSV 反义引物：5' _ AATCTAAATCGGAAGGAGGG _ 3'
[0032] PNRSV 探针；5' _ TCGAATGGTTGGATTGGGATGGTGGAGGACTATAAGGTGG _ 3'。
[0033] (2)植物总RNA的提取、RT-PCR扩增及质粒构建。
[0034] 植物总RNA的提取参见《分子克隆》第H版。反转录按照Promega反转录试剂盒 说明书进行；然后取上述反转录产物，加入PCR缓冲液（dNTPs200yM，Mg"1.5ymol/L),正 反义引物各 0. 5 y M，Taq 酶 1U，&0 补足至 20 y L ;反应程序为；94°C，5min ;94°C，30s ;57°C， 30s ;72°C，30s ;30个循环，4°C保存。RT-PCR结束后取扩增产物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳检 巧||。英光标记RT-PCR反应体系及扩增条件同上，正义引物浓度为0. 1 y mol/L，反义引物为 切3标记引物浓度为1. 0 y mol/Lo
[00巧]用上述特异的引物对PNRSV和ASGV侵染的病叶总RNA分别进行RT-PCR扩增，纯 化DNA片段，pGEM-T载体连接，转化E. coli畑5 a，提取质粒，测序。
[0036] (3)杂交与扫描。将两种英光标记扩增产物94C热变性，然后立即冰浴；各取 PCR产物与杂交液充分混匀，加入芯片反应区，42°C杂交；杂交反应结束后，取出芯片依 次在A(1XSSC，0. 2% SD巧，B(0. 2XSSC)，C(0. 1XSSC)的洗液中各漂洗，室温瞭干后用 GenePix4000B扫描仪扫描。
[0037] (4)芯片特异性试验、灵敏度试验及重复性试验。
[0038] 将ASGV和PNRSV探针于玻片上分别重复4次成一列。将PNRSV和ASGV分别进行 RT-PCR，并且用PNRSV和ASGV质粒进行两重PCR，并设10种阴性病毒为阴性对照W及水为 空白对照，产物分别与探针杂交检验其特异性。将PNRSV和ASGV探针于玻片上各重复8次 成两列。将ASGV和PNRSV质粒定量后按10倍梯度稀释成1〇5?1〇2拷贝/uL，每个稀释 度各取1 y L作为模板英光标记PCR，扩增产物与探针杂交检验灵敏度。将ASGV和PNRSV探 针于玻片上分别重复4次成一列。W ASGV和PNRSV的RNA为模板，连续进行多次检测。为 检验不同批次间芯片的稳定性，利用ASGV和PNRSV的同一 RT-PCR产物于不同批次制备的 芯片进行杂交检验重复性。
[0039] 2试验结果
[0040] 2. 1 ASGV 和 PNRSV 的 RT-PCR 检测结果
[0041] W感染ASGV和PNRSV的苹果叶片和禮桃总RNA为模板，RT-PCR，扩增产物在琼脂 糖凝胶电泳中均有条带，与预期长度414bp和340bp基本一致，而对照样品未出现任何条 带（图1)。测得序列与GenBank序列同源性均达90%W上。该说明扩增的条带是ASGV和 PNRSVCP基因组特异扩增得来的，RT-PCR体系正常。
[0042] 2. 2特异性试验结果
[004引根据试验结果（图2)可见，ASGV和PNRSV杂交分别产生强信号。ASGV和PNRSV 的两重PCR产物杂交后，两种病毒均产生强信号。而10种阴性对照及空白对照均无阳性信 号产生；说明该芯片对检测ASGV和PNRSV具有极好的特异性。
[0044] 2. 3灵敏度试验结果
[0045] 根据试验结果（图3)可见，随着质粒模板量的降低，杂交信号也逐渐减弱。104拷 贝时检测的英光信号很强，ASGV和PNRSV都可检出；1〇3拷贝时检测的英光信号较强，ASGV 和PNRSV也可检出；1〇2拷贝时，检测的英光信号很弱，检出PNRSV, ASGV未检出。W检出所 有基因为标准，本方法的灵敏度可达到1〇3拷贝。
[0046] 2. 4重复性试验结果
[0047] 杂交扫描后，分析信号值，取每个探针4次重复的信号平均值，6次杂交数据杂交 信号基本一致，说明芯片杂交检测体系的结果基本稳定。而且不同批次芯片间有较好的重 复性。
【权利要求】
1. 用于检测苹果莖沟病毒（Applestem grooving virus)的一对特异性引物和一条探 针，其特征在于：所述的一对特异性引物的核苷酸序列分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2 所示，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示。
2. 权利要求1所述的一对特异性引物和一条探针在制备检测苹果茎沟病毒的试剂中 的应用。
3. -种检测苹果茎沟病毒的生物芯片，其特征在于：含有权利要求1所述的探针。
4. 按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：其为基因芯片。
5. 用于检测李属坏死环斑病毒（Prunusnecroticringspotvirus)的一对特异性引 物和一条探针；其特征在于：所述的一对特异性引物的核苷酸序列分别为SEQIDNo. 4和 SEQIDNo. 5所示，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 6所示。
6. 权利要求1所述的一对特异性引物和一条探针在制备检测李属坏死环斑病毒的试 剂中的应用。
7. -种检测李属坏死环斑病毒的生物芯片，其特征在于：含有权利要求1所述的探针。
8. 按照权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：其为基因芯片。
【文档编号】C12R1/94GK104513866SQ201410690315
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】王进忠, 谷瑞华, 郝少东, 杨宝东, 张志勇, 王升启 申请人:北京农学院