猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用，属于猪伪狂犬病毒毒株的分离和应用领域。本发明首先公开了一株猪伪狂犬病毒PRV-JL株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9903。本发明还公开了一种应用所述PRV-JL株制备猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括：(1)扩增猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。动物实验结果表明，本发明PRV-JL株制备的灭活疫苗安全性高，免疫原性好，免疫保护率高，对新分离变异株强毒株及PRV闽A株强毒均能提供完全保护，能够对目前流行的猪伪狂犬病实现有效防治。CGMCC No 990320141028
【专利说明】猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪伪狂犬病毒毒株，尤其涉及一株性能优异的猪伪狂犬病毒 (Pseudorabies Virus)强毒株，本发明还涉及由所述猪伪狂犬病毒强毒株制备的灭活疫苗 及其应用，属于猪伪狂犬病毒毒株的分离和应用领域。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的，往往以爆发流行的方式流行。初生仔猪感 染本病毒后死亡率极高，成年猪感染该病毒多呈隐性状态，死亡率较低，但怀孕母猪容易发 生流产、弱胎、死和木乃伊胎。健康猪与带毒猪、病猪直接接触可感染本病毒。该病毒的免疫 抑制作用可增强受感染成年猪对其他病原的易感性，结果导致受病毒感染猪死亡率增加。 近年来，猪伪狂犬发病的季节性不明显，发病率上升，除猪蓝耳病以外，猪伪狂犬病已成为 危害母猪繁殖功能的第二大疾病。
[0003] 预防该病最行之有效的办法是接种疫苗。目前，市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数 为猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗和灭活疫苗。由于流行毒株不断发生变异，与市售疫苗在免 疫原性方面存在差异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。 因此，亟待开发新的免疫原性好的猪伪狂犬病疫苗，实现对目前流行的猪伪狂犬病的有效 防治。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一株分离的猪伪狂犬病毒毒株，采用该毒株制 备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治目前流行的猪伪狂犬病。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0006] 本发明首先公开了一株分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株。
[0007] 本发明将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株提交专利认可的机构进行保藏，其微生 物保藏编号为=CGMCC No. 9903 ;分类命名是：猪伪狂犬病毒；保藏时间是：2014年10月28 日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0008] 本发明从吉林某发病猪群母猪死胎的脑组织、扁桃体等组织中分离出一株猪伪狂 犬病毒PRV-JL株。将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株空斑纯化后，测定猪伪狂犬病毒PRV-JL 株的病毒含量为IO7 96TCID5tlA). lmL。采用PCR方法扩增PRV-JL株的gE基因，结果扩增出 一条1740bp的条带，完全符合gE基因的大小。免疫荧光法检测结果表明，分离病毒PRV-JL 株感染的盖玻片培养物，在细胞质中存在许多绿色的荧光灶，而未接种分离病毒的阴性对 照盖玻片培养物没有特异性荧光出现。病毒PRV-JL株gE基因的进化树分析结果可见，基 因进化树分析图中，新分离毒株PRV-JL株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基 酸序列比对发现，新分尚株PRV-JL株与大多数毒株相比，在54位、448位和512位发生了 54位（G-D)、448位（V-I)和512位（G-S)突变，在第48位插入一个D，同时第492-495位 的4个D之间也插入一个D，变成了 5个连续的D。本发明分离的PRV-JL株是一株猪伪狂 犬病毒变异株强毒。
[0009] 本发明猪伪狂犬病毒PRV-JL株能够应用于制备预防猪伪狂犬病的疫苗或药物。
[0010] 本发明进一步公开了一种预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，包括：免疫上有效量的 猪伪狂犬病毒PRV-JL株和药学上可接受的佐剂。
[0011] 本发明还公开了一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1)扩增 所述的猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；（2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备 水相和油相；（4)将水相和油相混合，乳化，即得。
[0012] 其中，步骤（1)所述扩增为采用Vero细胞培养猪伪狂犬病毒PRV-JL株；优选的， 将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株按病毒维持液量的1 %接入形成单层的Vero细胞培养物 中；所述培养条件优选为37 °C旋转培养。
[0013] 步骤⑵按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02:100;所述灭活 剂为二乙烯亚胺溶液；优选的，按照质量g/体积mL计，所述二乙烯亚胺溶液的浓度为2%。 所述灭活为在30°C灭活60h ;优选的，在30°C、lOOr/min摇床上灭活60h，然后加入2%硫代 硫酸钠溶液，终止灭活。
[0014] 步骤（2)所述浓缩优选为浓缩5倍。
[0015] 步骤（3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4 :96 混合均匀，得到水相；
[0016] 所述制备油相包括：将白油、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94 :6 :1. 5混合均匀。
[0017] 步骤（4)将水相和油相按照体积比I : 1. 5混合均匀。
[0018] 安全性试验结果表明，本发明制备的猪伪狂犬病灭活苗对家兔和猪安全性好，免 疫后全部家兔或猪精神状态良好，饮食正常，注射部位亦未见异常，均健康存活，无猪伪狂 犬病典型症状反应。免疫原性试验结果表明，在断奶仔猪免疫攻毒试验中，本发明分离的猪 伪狂犬病毒PRV-JL株制备的灭活疫苗保护率为100%，高于市售Bartha-K61株弱毒疫苗 的保护率；在妊娠母猪攻毒保护试验中，PRV-JL株灭活疫苗对新分离变异株强毒PRV-JL株 及PRV闽A株强毒均能提供完全保护。证明本发明分离的猪伪狂犬病毒PRV-几株免疫原 性好，能够对目前流行的猪伪狂犬病实现有效防治。
[0019] 本发明所渉及到的术语定义
[0020] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0021] 术语"分离的"意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料 可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分（例如细胞质或膜 组分）。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。
[0022] 可互换使用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"指这样的药物组合物，其包括在动物 中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另 外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括 例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的 生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已 知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超 过一种上述组分。
[0023] 术语"佐剂"意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原 性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样 系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细 胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化 铝、表面活性物质。
[0024] 术语"免疫有效量"是将引发针对猪伪狂犬病毒的免疫应答的无毒力猪伪狂犬病 毒毒株的量。"免疫有效量"将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、大小、健康状况等因素。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为猪伪狂犬病毒PRV-JL株的PCR鉴定结果；其中，M :DNA Maker DL 2000 ;1 : PRV-JL株；2 :猪伪狂犬病毒闽A株；3 :阴性对照；
[0026] 图2为猪伪狂犬病毒PRV-JL株感染细胞的免疫荧光法检测结果；其中，A为未接 种分离病毒的阴性对照；B为PRV-JL病毒感染细胞；
[0027] 图3为猪伪狂犬病毒PRV-JL株gE基因的进化树分析；
[0028] 图4为猪伪狂犬病毒PRV-JL株gE基因推导的氨基酸序列比对结果。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0030] 实施例1猪伪狂犬病毒毒株的分离
[0031] 1、实验方法
[0032] I. 1病料采集
[0033] 病料采自吉林某发病猪群母猪死胎的脑组织、扁桃体等，以1 :10加入DMEM，研磨， 制备组织悬液，反复冻融3次，12, OOOrpm离心IOmin取上清经0. 22 μ m滤器过滤。将滤出 液置-80°C冰箱冻结保存。
[0034] L 2分离培养
[0035] 将上述病料按病毒培养液的10%含量接入尚未形成单层的绿猴肾细胞系Vero细 胞培养物中，置于37°C感作lh，加入含2%小牛血清的DMEM培养液，37°C培养5日。冻融2 次后第二代培养4天，收获培养液，经2次冻融后，收毒；连续传代5代，获得原始毒种。
[0036] 1. 3病毒的基础种子批建立
[0037] 取原始毒种，按病毒维持液量的1%接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37°C 培养，当病变达到80%时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒；连续传代6代，获得 病毒的基础种子。
[0038] 1. 4病毒的生产种子批建立
[0039] 取基础种子，按病毒维持液量的1%接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37°C 培养，在5% C02,37°C条件下培养，每天对细胞病变效应（CPE)进行观察。
[0040] 2、实验结果
[0041] 细胞病变效应的观察结果显示：细胞膨大，圆缩，继而开始脱落逐渐形成空斑病 灶，并且有"拉网"现象；当细胞病变达到80%时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收 毒。连续传代11代，最终获得一株猪伪狂犬病毒毒株，命名为PRV-JL株。
[0042] 实施例2猪伪狂犬病毒毒株的鉴定
[0043] 对本发明实施例1分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株进行鉴定。
[0044] 1、病毒的蚀斑克隆
[0045] 用维持液将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株作10倍系列稀释，取其中的1(Γ5、10' 10' KT8接种24孔细胞板，每个稀释度接种4个孔，100 μ 1/孔。置于37°C温箱孵育Ih 后，每孔加入ImL的44°C营养琼脂，待营养琼脂凝固后将细胞板翻转，并置于含5% CO2的 细胞培养箱内，逐日观察。培养4d后对每个稀释度上的空斑进行计数，计算空斑形成单 位（PFU)，观察空斑形态及大小，挑出小而孤立的空斑，加入0. 5mL营养液中，冻融2次， 3, 000r/min，离心IOmin,吸取上清，做病毒增殖，测定克隆株病毒的毒价。
[0046] 结果显示，24孔细胞板中分离的病毒经过4天培养，能产生空斑的最大稀释 度为ΚΓ6,在KT 6稀释度的细胞单层上可看到单个存在的可数空斑，直径在2?5mm之 间，空斑形态不规则，4个孔内的空斑个数有差异，最多的空斑数为30个，最少的仅有10 个。最终PFU为I. 6X l〇7〇. lmL。按照Reed-Muench法计算得到克隆毒株的病毒含量为 IO7.96TCID50A). lmL。
[0047] 2、病毒PCR鉴定
[0048] 分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株空斑纯化后，采用PCR方法扩增gE基因。
[0049] PCR扩增反应体系（50 μ 1体系）：
[0050]
【权利要求】
1. 一株分离的猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus)PRV-JL株，其特征在于，其微生物 保藏编号是：CGMCC No. 9903。
2. 权利要求1所述猪伪狂犬病毒PRV-JL株在制备预防猪伪狂犬病疫苗中的应用。
3. -种预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫上有效量的权利要求1 所述猪伪狂犬病毒PRV-几株和药学上可接受的佐剂。
4. 一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)扩增权利要求1所述的猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；（2)加入灭活剂灭活 病毒液，浓缩；（3)制备水相和油相；（4)将水相和油相混合，乳化，即得。
5. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)所述扩增为采用Vero细胞 培养猪伪狂犬病毒PRV-几株。
6. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤⑵按照质量g/体积mL计，灭 活剂与病毒液的比例为〇. 02 :100 ;所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液；优选的，按照质量g/体 积mL计，所述二乙烯亚胺溶液的浓度为2%。
7. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)所述浓缩优选为浓缩5倍。
8. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于： 步骤（3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4 :96混合 均匀； 所述制备油相包括：将白油、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94 :6 :1. 5混合均匀。
9. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4)将水相和油相按照体积比 1 :1. 5混合均匀。
10. 权利要求4至9任何一项所述制备方法制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗。
【文档编号】C12R1/93GK104388396SQ201410707320
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】王全杰, 张智明, 丁国杰, 步帆, 王彬, 窦海燕, 杨朋欣, 李来旭, 张凤强, 张祎, 冯闻迪 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司