一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育的制作方法
【专利摘要】一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育，属于生物工程中发酵【技术领域】。本发明以实验室保藏的一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)ST 06为出发菌株；经常压室温等离子体(ARTP)诱变后，经过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中筛选得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的菌株ST12-96，对其进行发酵优化显示在温度30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养48h达到对数生长期，将对数生长期的菌体以10％(V/V)的接种量接入发酵培养基，在30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养7d，对发酵产物进行定量检测，植物甾醇转化为AD的转化率达到了75.95％，产物AD含量达到8.41g/L，AD占到AD与ADD总和的95.02％。本发明首次将解淀粉芽孢杆菌用于AD的生物合成。CCTCC NO: M 201427320140628
【专利说明】-株高产雄留-4-烯-3, 17-二酮的植物留醇转化菌株的选
【技术领域】
[0001] 一株高产雄留-4-烯-3, 17-二酮的植物留醇转化菌株的选育，属于生物工程中发 酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 甾体药物（steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的药物，其具 有很强抗感染、抗过敏、抗病毒及抗休克的药理作用，是临床上一类重要的药物。主要分为 两类药物：糖皮质激素和性激素。糖皮质激素用于临床上的药物主要有醋酸可的松、醋酸地 塞米松、醋酸氟轻松等。性激素主要有雌性激素、雄性激素、蛋白同化激素及孕激素等。性激 素药剂主要包括：黄体酮、苯丙酸诺龙、甲睾酮等。近年来随着人们对生活质量、身体健康需 求的日益提高以及当今社会日益加重的老龄化问题，留体药物体现的价值日益显著。甾体 药物被广泛用于抗肿瘤，抗炎，抗痉挛和抗过敏；预防和治疗许多严重性的疾病，例如：激 素依赖型的乳腺和前列腺癌、结肠癌、肥胖症、慢性糖尿病、类风湿性关节炎、高血压、哮喘、 湿疹、炎症、代谢紊乱、神经性退化老年症、中枢神经系统紊乱症、妇科疾病、过敏性休克、肾 上腺激素分泌不全、抑制HIV整合酶、HIV的感染、AIDS等。在最畅销的药物产品中，留体药 物是仅次于抗生素的第二大类药物，留体药物的年产量超过了 100万吨，全球销售总额超 过了 100亿美元。
[0003] 在甾体激素的生产过程中 AD (androst-4-ene_3, 17-dione，雄甾-4-烯-3,17-二 酮）和六00(&11(11'〇8七&-1，4-(116116-3，17-(1;[0116，雄留-1，4-二烯-3，17-二酮）是重要的中 间体，它们可用于合成矿质皮质激素（螺内酯）、氢化可的松、雄激素（睾酮、甲基睾酮）、甲 基雄留烷醇酮、卵泡激素（乙炔雌二醇、乙炔雌二醇甲酯、雌二醇、雌三醇）、黄体激素等十 几种留体药物。
[0004] 目前雄甾烯酮AD(D)的制备方法主要有以下三种：（一）从动植物的组织液中直 接提取，产率很低而且成本较高，不适宜大规模工业化生产；（二）由非留化合物化学法直 接合成，不仅成本高、收率低，而且污染严重；（三）从植物和动物中分离出的类固醇中间体 原料合成。
[0005] 第三种生产方式是目前生产雄留烯酮的主要方式，这种生产方式使用的原料主要 是薯蓣皂素，由于以薯蓣皂素为原料存在成本高昂等诸多缺点，因此各国科学家都在寻找 新的廉价原料代替皂素用来生产留体药物。由于动植物留醇是从制糖、食用油精炼等行业 的废料中提取出来的，具有价格低廉易获得的优点，因此微生物法转化动植物留醇为雄甾 烯酮成为各国科学家新的研究热点。20世纪50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有 双链的大豆留醇为原料生产出AD和ADD。20世纪70年代初，日本的研究学者有马启利用 微生物降解胆固醇成功生产ADD。2002年Dias等将油脂脱臭蒸馏物中富集的植物留醇混 合物用分枝杆菌NRRLB-3805处理得到AD和ADD，且收率相当高。
[0006] 由于大多数留醇侧链降解菌无法积累单一产物，而是同时积累三个结构相近且很 难进行分离纯化的化合物（AD、ADD与9 a -OH-AD)，所以大多数甾醇侧链降解菌无法在工业 上应用。本实验室保藏有一株能有效转化植物留醇为AD和ADD混合物的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloiquefaciens)ST 06,其混合产物中 AD:ADD = 2.5 :1，混合物中 ADD 的比例 还是比较大，15g/L底物投加量，30°C，160rpm条件下，发酵7d，AD的产量为2. 84g/L，ADD的 产量为I. 18g/L。实验室前期选育获得一株转化植物留醇为单产雄留-1，4-二烯-3, 17-二 酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloiquefaciens)ST 06-95,已保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 208135。已获得国家发明专利，专利号 ZL200810155130. 7。
[0007] 本发明通过常压室温等离子体快速诱变的方法，对原始菌株B. amyloiquefaciens ST 06进行诱变处理，经过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中选育获得了一株高产 AD的菌株，15g/L底物投加量，30°C，160rpm条件下，发酵7天，AD产量为8. 41g/L，ADD产量 为0. 45g/L，AD :ADD = 18:1。对其发酵条件进行了初步研究，为微生物转化留体药物工业 化提供了基础。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供：运用常压室温等离子体诱变技术，对一株有效地转化植 物甾醇为AD和ADD的菌株B. amyloiquefaciens ST 06进行诱变处理，得到了一株能高产 AD的菌株B. amyloiquefacien ST 12-96,诱变后得到的菌株不仅提高了 AD和ADD的转化 率，从39. 04 %提高到了 86. 05 %，还将AD在产物中的比例从2. 5:1提高到了 18:1。为微生 物甾体转化的工业化提供了有益的指导。
[0009] 本发明的技术方案：
[0010] 本发明采用常压室温等离子体（ARTP)诱变技术，得到一株高产雄 甾-4-烯-3, 17-二酮的植物留醇转化菌株，该菌株中，植物留醇转化为AD和ADD的转化 率从39. 04 %提高到了 86. 05 %，产物中AD的比例从2. 5:1提高到了 18:1，该菌株命名为 B. amyloiquefaciens ST 12_96〇
[0011] 菌株诱变选育方法：
[0012] (1)出发菌株生长曲线与常压室温等离子体（ARTP)诱变致死率曲线的制定：以实 验室保藏的能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株B. amyloiquefaciens ST 06作为出发 菌株，选用10 μ 1处理菌液在进行诱变处理，选择的照射时间60s、90s、120s、150s、180s，制 定致死率曲线，选择致死率在70?90%的时间作为诱变时间；
[0013] (2)出发菌株经ARTP照射150s，诱变后用无菌生理盐水适当稀释，然后涂布于以 甾醇作为唯一碳源的培养基LCl上，30°C培养48h ;
[0014] (3)从LCl平板中挑取单菌落克隆500株，接种到以雄甾-4-烯-3, 17-二酮AD为 唯一碳源的培养基LC2固体培养基中，30°C培养48h ;选择在LCl上长势良好，LC2上不长或 长势缓慢的菌落268株进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率提高及产物中AD所占比例提高的菌 株；
[0015] 所述培养基组成：
[0016] 基本培养基 LC (g/L)为：CH2COONH4L 5, MgSO4 · 7H20 0· 2, K2HPO4O. 4, KH2PO4O. 8， FeSO4 · 7H20 5Xl(T3，ZnS04 · 7H20 2Xl(T3，MnCl2 · 4Η20 5ΧΚΓ4;
[0017] 培养基LCl :在LC基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为15g/L ;甾醇成分中豆甾醇 > 96% ；
[0018] 培养基LC2 :在LC基础上，以AD为唯一碳源，含量为10g/L ;
[0019] 发酵培养基（g/L):葡萄糖20, K2HPO4O. 2, MnCl25X 1〇Λ植物甾醇15,羟丙 基-β-环糊精45,大豆蛋白胨10,初始pH 7.0 ;
[0020] 发酵条件：30°C，160rpm发酵7d，接种量10%。
[0021] 用所述ST12-96菌株发酵产雄留-4-烯-3, 17-二酮的方法，其特征是ST12-96在 固体培养基（g/L):蛋白胨5,葡萄糖5,牛肉膏3,琼脂20, pH 7.0,培养46?48h，然后转 入种子培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏6, NaCl 15, pH 7.0,培养24h，按10% 接种量接种于发酵培养基（g/L):葡萄糖20, K2HPO4O. 2, MnCl25Xl(T4,植物甾醇15,羟丙 基-β-环糊精45,大豆蛋白胨10,初始pH 7.0,发酵7d。
[0022] 产物的分离提纯：取一定的量的发酵液，用5倍体积的乙酸乙酯萃取，剧烈振荡 1?2min,沉淀后,取上清过0. 22 μ m的有机滤头。
[0023] 液质联用对产物进行鉴定：将萃取处理后的发酵产物进行检测，确定产物的分子 量，确定广物为雄留 _4_烯-3,17-二酮和雄留-1，4-二烯-3, 17-二酮。
[0024] 薄层层析（TCL)定性分析：用处理好的样品点样于GF254薄板，展开相为石油醚： 乙酸乙酯=6:4,饱和30min后，自然风干薄板，喷涂50%的硫酸，在KKTC下烘烤20min，然 后缓慢降至室温。
[0025] 紫外比色定量：将上述样品用乙酸乙酯稀释适当的倍数，用U3000型紫外分光光 度计测其吸光值，与标准品对照，检测波长为254nm和298nm。高效液相色谱定量：采用高 效液相对产物进行定量测定，确定该菌的转化得率。
[0026] 本发明的有益效果：以本实验室保藏的一株有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌 株ST 06作为出发菌株；经常压室温等离子体（ARTP)诱变后，通过一系列的初筛和复筛，从 500株变异菌株中筛选得到高产AD的菌株ST12-96,并对该菌的发酵条件进行了探索与初 步优化，结果显示在30°C、pH 7. 0、160rpm的条件下培养48h达到对数生长期，将对数生长 期的菌株以10% (V/V)的接种量接入发酵培养基，在30°C、pH 7.0、160rpm的条件下培养 7d，对发酵产物进行定量检测，产物AD含量为8. 41g/L，AD占 AD和ADD总和的95. 02 %。该 发明为微生物转化留体药物的工业化提供了基础。
[0027] 转化所用底物为生产其他药物的下脚料--植物留醇（主要含谷留醇，菜油甾醇 和豆留醇等，本发明所用的植物留醇中豆留醇含量>96% )，或毛纺工业和油脂工业的废 水和下脚料，实现废物的综合再利用。产品的纯度较高，转化率高，菌株稳定性好，传代至十 代后其转化率没有下降。技术的可移植性强，只要一般的发酵车间（如抗生素、维生素、氨 基酸生产车间）即可满足其生产需要，不需要购置特殊设备和仪器，易于推广应用，经济效 益显著！
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图IADD、AD标样的HPLC图谱；
[0029] 图2发酵产物的HPLC图谱；
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :高产雄留-4-烯-3,17-二酮菌株的常压室温等离子体诱变筛选
[0031] 以实验室保藏的一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株ST 06为出发菌株， 制定其生长曲线、常压室温等离子体（ARTP)诱变致死率曲线，诱变后稀释适当梯度涂布于 以植物留醇为唯一碳源的固体培养基LCl (LC+植物留醇）中培养48h。从LCl平板上挑 取500株长势良好的菌株接种到LC2 (LC+AD)固体培养基上，30°C培养48h，进行初筛，初 筛共得到268株阳性突变株。对在LCl上长势良好，LC2上不长或长势缓慢的268株菌株 进行摇瓶复筛，挑选转化率提高，AD所占比例提高的菌株。菌落经鉴定为解淀粉芽孢杆菌 B. amyloiquefaciens ST12-96。
[0032] 实施例2 :突变菌株的转化能力的研究
[0033] 将实施例1中筛选的到的菌株ST12-96在固体培养基（g/L)蛋白胨5,葡萄糖5， 牛肉膏3,琼脂20, pH 7.0,培养46?48h，然后转入种子培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨 10,牛肉膏6, NaCl 15, pH7.0,培养24h，按10%接种量接种于发酵培养基（g/L):葡萄糖 20, K2HP040.2, MnCl25X10_4,植物甾醇15,羟丙基-β-环糊精45,大豆蛋白胨10,初始pH 7. 0,发酵7d。取一定量的发酵液，用5倍体积的乙酸乙酯萃取发酵液，用0. 22 μ m的有机滤 膜过滤上清,过滤后用HPLC分析该溶液中AD、ADD的含量。如图2所示，标样AD对应的出 峰时间为7. 28min，标样ADD对应的出峰时间为9. 88min，诱变后的菌株发酵后，发酵液中的 AD含量明显提高。
【权利要求】
1. 采用常压室温等离子体（ARTP)诱变技术，得到一株高产雄留-4-烯-3, 17-二酮AD 的植物留醇转化菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌ST 12-96,该菌株相较于出发菌株解 淀粉芽孢杆菌ST 06,在底物投加量为15g/L情况下，发酵7d后，AD的产量从2. 84g/L提高 到了 8. 41g/L，AD在AD与ADD的产物混合物中的比例由2. 5:1提高到了 18:1。
2. 权利要求1所述菌株ST 12-96是通过如下方法获得的 (1) 出发菌株ST 06常压室温等离子体（ARTP)诱变致死率曲线的制定：本研究采用高 纯氦气作为等离子体的工作气体，电源功率40W，照射距离2mm，等离子体的温度<40°C，气 流量12. 5L/min，处理菌液lOiil，选择照射时间6〇8、9〇8、12〇8、15〇8、18〇8，制定致死率曲 线，选择致死率在70?90%的时间作为诱变时间； (2) 出发菌株ST 06经ARTP照射150s，诱变后用无菌生理盐水适当稀释，然后涂布于 以甾醇作为唯一碳源的培养基LC1上，30°C培养48h ; (3) 从留醇平板LC1中挑取单菌落克隆菌株500株接种到以雄留-4-烯-3, 17-二酮 AD为唯一碳源的培养基LC2固体培养基中，30°C培养48h ;选择在LC1上长势良好，LC2上 不长或长势缓慢的菌落268株进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率及产物中AD所占比例提高的 菌株；得到一株高产雄留-4-烯_3, 17-二酮AD的植物留醇转化菌株； 所述培养基组成： 基本培养基1^：&/1)为：0120)0順41.5，]\%504.711 20 0.2，1(2册040.4，腿2?040 . 8，卩6504? 7H20 5X 10_3，ZnS04 ? 7H20 2X 10_3，MnCl2 ? 4H20 5X 10-4; 培养基LC1 :在LC基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为15g/L ;甾醇成分中豆甾醇> 96% ； 培养基LC2 :在LC基础上，以AD为唯一碳源，含量为10g/L。 发酵培养基（g/L):葡萄糖20，K2HP040. 2，MnCl25X 10_4,植物甾醇15,羟丙基-环糊 精45,大豆蛋白胨10,初始pH 7.0 ; 发酵条件：30°C，160rpm发酵7d，接种量10%。
3. 用权利要求1所述ST12-96菌株发酵产雄留-4-烯-3, 17-二酮的方法，其特征是 ST12-96在固体培养基（g/L):蛋白胨5,葡萄糖5,牛肉膏3,琼脂20, pH 7.0,培养46? 48h，然后转入种子培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏6, NaCl 15, pH 7.0,培养 45h，按10%接种量接种于发酵培养基（g/L):葡萄糖20，K2HP040. 2，MnCl25X10_4,植物甾醇 15,羟丙基-0-环糊精45,大豆蛋白胨10,初始pH 7.0,发酵7d。
【文档编号】C12N15/01GK104403974SQ201410746848
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】饶志明, 刘超, 张显, 杨套伟, 徐美娟 申请人:江南大学