一种阻断hiv-1感染的ccr5δ32慢病毒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种阻断HIV-1感染的CCR5?32慢病毒及其制备方法，CR5?32慢病毒具有SEQ ID NO.6所示的基因序列，CR5?32慢病毒的制备方法包括2对引物和一个连接引物的设计、32碱基缺失的CCR5基因片段（CCR5?32）的构建以及穿梭质粒pMXs-Puro的重组等；所述CCR5?32慢病毒具有同时阻断R5和X4嗜性的HIV-1感染的作用。
【专利说明】—种阻断HIV-1感染的CCR5 Δ32慢病毒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于艾滋病防治领域，涉及一种阻断Hiv-1感染的CCR5 Δ 32慢病毒，用于阻断以CCR5和CXCR4为辅助受体的HIV-1对靶细胞的感染。
【背景技术】
[0002]趋化因子受体5 (CCR5)是CC亚家族趋化因子MIP-1和RANTES的特异性受体。CCR5属G蛋白偶联受体家族，有7个跨膜区。近年来，研究发现CCR5能辅助HIV-1感染靶细胞，因此，自其被发现后一直是人们关注的热点。HIV-1感染宿主靶细胞的过程的起始阶段是由病毒囊膜上的糖蛋白gpl20和宿主细胞上的受体⑶4与趋化因子受体如CCR5、CXCR4结合而引起。这个三分子复合物之间的相互作用使gpl20-gp41复合物的构型发生变化，促使病毒与宿主细胞膜发生融合。大部分HIV-1的传播是以CCR5作为辅助受体的，这部分HIV-1毒株被称为R5嗜性。但也有一部分HIV-1是以CXCR4为辅助受体，称为X4嗜性。
[0003]鉴于CCR5在HIV-1感染中的重要作用，该分子成为阻断HIV-1感染的重要靶点。目前，已有针对CCR5的小分子阻断剂(maraviroc)上市，但是该拮抗剂仅能阻断以CCR5为辅助受体的HIV-1感染，对于CXCR4嗜性的HIV-1则无效。另外，其它以CCR5为靶点的治疗方法或策略均基于敲除CCR5的基因治疗手段，利用包括RNA1、锌指蛋白没技术、TALEN技术、CRISPR技术等基因操作技术敲除外周血T淋巴细胞或造血干细胞上的CCR5基因，以达到阻断HIV-1感染的目的。但上述治疗药物或方法均是针对R5嗜性的HIV-1，对于X4嗜性的无效。
[0004]CCR5基因突变可以对HIV-1的感染产生抵抗或阻断。人们发现高加索人中有一种CCR5的突变型等位基因的发生率很高(约9.2%)，使该基因型人群受HIV-1感染的机率下降。突变主要是由CCR5基因的外显子区缺失了 32对碱基(CCR5A32)造成。小部分高加索人是CCR5 Δ 32 / CCR5 Δ 32纯合子基因型，而大部分则是CCR5 / CCR5 Δ 32杂合子基因型。调查结果显示，HIV-1感染的高加索人中没有发现CCR5 Δ 32突变的纯合子基因型，而杂合子基因型的人群感染率也比普通人群低35%左右。杂合子基因型能使HIV-1感染者的AIDS疾病进程减慢，发病期延迟2?4年以上。另外，值得一提的是，与野生型相比，CCR5 / CCR5A 32杂合子基因型个体的外周血淋巴细胞中的HIV-1复制水平显著降低。这可能是因为，CCR5翻译后转移到细胞膜前，需在内质网中经过磷酸化修饰和多聚化翻译才能成为成熟CCR5。而CCR5A32由于基因的编码区缺失了 32对碱基，造成了读框错误，产生一个无功能的受体，这种受体不能进行磷酸化修饰，不支持胞膜融合。而且，CCR5A32和CCR5可以在内质网中形成异二聚体，使CCR5复合物滞留在内质网，减少在细胞膜表面的表达，从而抵御HIV-1的感染或减少感染的机会。
[0005]但是令人奇怪的是，CCR5 Δ 32纯合子和杂合子基因型的高加索人对R5和X4嗜性的HIV-1的感染均有抵抗性。著名的“柏林病人”因移植了 CCR5A32纯合子基因型供体的骨髓而治愈了艾滋病，该病人体内不仅检测不到R5嗜性的HIV-1，X4嗜性的病毒也检测不到。以上结果说明，CCR5 Δ 32基因型编码的结构缺失型CCR5蛋白，不仅能够阻断R5嗜性的HIV-1，还能够阻断X4嗜性的HIV-1。其机制为:CCR5A32也可以和CXCR54内质网中形成异二聚体，使CXCR4复合物滞留在内质网，减少在细胞膜表面的表达，从而抵御X4嗜性HIV-1的感染。因此，CCR5 Δ 32基因编码的蛋白(暂称之为CCR5 Δ 32蛋白)是一种可以抵抗R5和X4嗜性的HIV-1感染的蛋白。但是，由于CCR5 Δ 32基因型在普通人群中十分罕见，我国尽在维吾尔族人群中发现了少数几例，汉族人群不携带此变异基因型。因此，如何使野生型个体产生对R5和X4嗜性的HIV-1感染产生阻断和抵抗有待研究。本发明构建了一种使野生型⑶4+T细胞产生CCR5 Δ 32蛋白，从而阻断HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种阻断HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒以及该慢病毒的制备方法，该病毒可以进一步用于造血干细胞的改造，为临床治疗艾滋病提供一种新的思路。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:一种阻断HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒，所述CCR5 Δ 32慢病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0008]所述CCR5 Δ 32慢病毒的制备方法包括以下步骤:
(1)分别设计CCR5cDNA序列的上下游引物P1、P2，CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对两侧的引物P3、P4，和连接引物P5 ;P1、P2、P3、P4、P5的序列如SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.5所示；
(2)利用PCR的方法，分别用P1、P3扩增CCR5Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第一 PCR产物，分别用P2、P4扩增CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第二 PCR产物；然后以P5作为连接引物，PU P2作为上、下游引物，扩增第一 PCR产物和第二 PCR产物，得到第三PCR产物(B卩32个碱基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR产物、第二 PCR产物、第三PCR产物的碱基序列如SEQID N0.7-SEQ ID N0.9 所示；
(3)将第三PCR产物回收，用PacI和Xho I内切酶酶切，连接到慢病毒表达载体穿梭质粒pMXs-Puro上，得到重组的穿梭质粒，重组的穿梭质粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示；
(4)用脂质体转染法将重组的穿梭质粒转染到慢病毒包装细胞Platinum-GP细胞内，48小时后包装出CCR5 Δ 32慢病毒表达载体，收集含有病毒的培养上清，经浓缩、纯化后得到CCR5 Δ 32慢病毒。
[0009]本发明通过模拟罕见的CCR5A 32基因携带者对HIV-1感染的抵抗，在体外构建CCR5 Δ 32缺失型基因，并进一步包装成CCR5 Δ 32慢病毒表达载体，感染HIV-1的靶细胞，使其具有阻断HIV-1感染的能力。与现有的针对CCR5的治疗和阻断HIV-1感染的方法相t匕，该病毒具有同时阻断R5和X4嗜性的HIV-1感染的功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1.CCR5 Δ 32基因片段序列扩增策略。先用两对引物分别扩增32个碱基两侧的片段，再用连接引物和CCR5上下游引物连接和扩增两个片段。
[0011]图2.pMXs-Puro穿梭质粒图谱。
[0012]图3.CCR5 Δ 32慢病毒表达载体感染的Jurkat细胞表面CCR5和CXCR4表达的流式细胞术检测。图中每幅流式细胞术检测图中上面的数字表示阳性细胞的百分比，下面的数字表示平均荧光强度。
[0013]图4.CCR5 Δ 32和Maraviroc对R5嗜性的HIV-1感染的阻断作用。A:对HIV-1感染的阻断效果，通过检测细胞培养上清中的HIV-1 p24蛋白浓度来比较，**表示与对照组相比，P<0.01 ;B:流式细胞术检测结果，图中上面的数字表示阳性细胞的百分比，下面的数字表示平均荧光强度。
[0014]图5.CCR5 Δ 32和Maraviroc对X4嗜性的HIV-1感染的阻断作用。#表示与对照组相比，P〈0.01。
【具体实施方式】
[0015]实施例1.制备CCR5 Δ 32慢病毒，包括以下步骤:
步骤1.根据CCR5 Δ 32基因型个体中缺失的32个碱基对的位置和序列，分别设计缺失的32个碱基对两侧引物及CCR5 cDNA序列的相关上下游引物。
[0016]设计CCR5 cDNA序列上下游引物如下:
Pl (SEQ ID N0.l):5’-CCTTAATTAAGGTGGAACAAGATGGATTAT-3’(含有 Pac I 酶切位点) P2 (SEQ ID N0.2):5’-CCGCTCGAGCGGATGTGCACAACTCTGACTG-3’ (含有 Xho I 酶切位点)；
设计缺失的32个碱基对两侧引物如下:
P3 (SEQ ID N0.3): 5’-TGTATGGAAAATGAGAGCTGCAGGTG-3’，
P4 (SEQ ID N0.4): 5’ -TTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCC-3’ ；
设计缺失的32个碱基两侧序列的连接引物如下:
P5 (SEQ ID N0.5):
5’ - GCCCCAAGATGACTATCTTTAATGTATGGAAAATGAGAGC-3’。
[0017]步骤2.利用PCR的方法，分别用P1、P3扩增CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第一 PCR产物，分别用P2、P4扩增CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第二 PCR产物；然后以P5作为连接引物，P1、P2作为上、下游引物，扩增第一 PCR产物和第二 PCR产物，得到第三PCR产物(B卩32个碱基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR产物、第二 PCR产物、第三PCR产物的碱基序列如 SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.9 所示；如图1 所示。
[0018]步骤3.第三PCR产物纯化使用过柱离心的方法，操作步骤和方法按着产品说明书进行。使用Pac I和Xho I内切酶对回收纯化的PCR产物进行双酶切，并使用过柱离心的方法纯化。
[0019]步骤4.CCR5 Δ 32慢病毒表达载体的构建
(4.1)将慢病毒表达载体包装试剂盒中的穿梭质粒pMXs-Puro经过大肠杆菌DH-5 α扩增后，使用质粒小量抽提试剂盒进行抽提，操作按说明书进行。然后将所得质粒经Pac I和Xho I内切酶双酶切，并使用过柱离心的方法纯化。质粒酶切产物与PCR酶切产物用Τ4连接酶连接，得到重组质粒。重组质粒进一步转化DH-5 α感受态细胞后,挑选克隆,大量扩增。经双酶切和测序鉴定正确重组,得到重组的穿梭质粒。所述穿梭质粒pMXs-Puro的图谱如图2所示，购于美国Cell B1labs公司，重组的穿梭质粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示。
[0020](4.2)慢病毒的包装
转染前一天将大约2 X 16慢病毒包装细胞Platinum-GP细胞接种于6cm培养皿中，使用无抗生素DMEM培养基。是用脂质体转染试剂将穿梭质粒转染到Platinum-GP细胞，48小时后即可包装出CCR5A32慢病毒表达载体。收集含有病毒的培养上清，使用慢病毒浓缩、纯化试剂盒处理病毒培养上清液，检测病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0021]实施例2.将实施例1制备的CCR5 Δ 32慢病毒感染靶细胞。
[0022]培养CD4+T淋巴细胞系Jurkat细胞，该细胞同时表达CCR5和CXCR4分子，是HIV-1的靶细胞。将浓缩、纯化的CCR5 Δ 32慢病毒表达载体感染Jurkat细胞，48小时后用含有嘌呤霉素(2ug/ml)的1640培养基进行筛选,每3天换液一次，10-14天后筛选出的活细胞。
[0023](I)将筛选出的活细胞在胞浆内稳定表达CCR5A32蛋白，以检测CCR5A32慢病毒表达载体对Jurkat细胞表面CCR5和CXCR4表达的影响。由于CCR5 Δ 32蛋白可以与CCR5和CXCR4分子在胞浆内形成异二聚体，将这些HIV-1辅助受体滞留在细胞内，阻止其跨膜表达。
[0024]我们用流式细胞术检测了感染CCR5 Δ 32慢病毒表达载体的Jurkat细胞表面CCR5和CXCR4分子的表达，结果显示，与对照细胞相比，感染CCR5 Δ 32慢病毒表达载体的Jurkat细胞表面的CCR5和CXCR4分子表达量将显著下降，见图3。说明10-14天后筛选出的活细胞具有HIV-1感染的抵抗能力。
[0025](2)将筛选出的活细胞用R5嗜性的HIV-1-GFP病毒感染，感染48小时后检测细胞培养上清中的P24蛋白含量，并用流式细胞术检测细胞内病毒含量，病毒含量越高表示感染率越高。用X4嗜性的HIV-1 PNL4-3假病毒(含荧光素酶报告基因)感染，48小时后检测Jurkat细胞的荧光素酶活性，活性越高表示病毒数量越多，感染率越高。如图4、图5所示，感染CCR5 Δ 32慢病毒表达载体的Jurkat细胞R5嗜性的HIV-1-GFP和X4嗜性的HIV-1PNL4-3假病毒感染率显著下降。
[0026]进一步将CCR5 Δ 32慢病毒表达载体与CCR5拮抗剂Maraviroc的阻断效果进行了比较，结果显示，两者对R5嗜性的HIV-1-GFP均有显著的阻断效果，但对于X4嗜性的HIV-1PNL4-3假病毒Maraviroc没有阻断效果(见图4、图5)。
[0027]上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种阻断Hiv-1感染的CCR5 Δ 32慢病毒，其特征在于，所述CR5 Δ 32慢病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
2.—种权利要求1所述的CR5 Δ 32慢病毒的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)分别设计CCR5cDNA序列的上下游引物P1、P2，CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对两侧的引物P3、P4，和连接引物P5 ;P1、P2、P3、P4、P5的序列如SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.5所示； (2)利用PCR的方法，分别用P1、P3扩增CCR5Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第一 PCR产物，分别用P2、P4扩增CCR5 Δ 32基因型缺失的32个碱基对位点5’侧和3’侧的序列，得到第二 PCR产物；然后以P5作为连接引物，PU P2作为上、下游引物，扩增第一 PCR产物和第二 PCR产物，得到第三PCR产物(B卩32个碱基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR产物、第二 PCR产物、第三PCR产物的碱基序列如SEQID N0.7-SEQ ID N0.9 所示； (3)将第三PCR产物回收，用PacI和Xho I内切酶酶切，连接到慢病毒表达载体穿梭质粒pMXs-Puro上，得到重组的穿梭质粒，重组的穿梭质粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示； (4)用脂质体转染法将重组的穿梭质粒转染到慢病毒包装细胞Platinum-GP细胞内，48小时后包装出CCR5 Δ 32慢病毒表达载体，收集含有病毒的培养上清，经浓缩、纯化后得到CCR5 Δ 32慢病毒。
【文档编号】C12N7/00GK104498444SQ201410747124
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】靳昌忠, 吴南屏, 程林芳 申请人:浙江大学