一种来源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶编码基因melC及其蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株链霉菌Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶的编码基因melC及其蛋白。Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2012432。本发明过程最终克隆获得1899bp，该序列包括553 bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC(包括两个编码基因melC1及melC2)，melC1基因产物为酪氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，运输铜离子至酪氨酸酶，帮助酪氨酸酶至细胞外。与国内外已报道酪氨酸酶编码基因进行对比，发现其与已报道的最高相似度仅为75％，其编码的氨基酸序列与已报道的最高相似度仅为83％，说明Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶编码基因是一种新型酪氨酸酶。CCTCC NO: M 201243220121103
【专利说明】-种来源于Streptomyces kath i rae SCM的酪氨酸酶编码 基因 melC及其蛋白
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从Streptomyces kathirae SC-I中克隆该酪氨酸酶编码基因，属于基 因工程【技术领域】。 技术背景
[0002] 随着有关人造黑色素的致癌、致病的报道不断增多，人们日益关注人造色素对人 体造成的危害。人们对色素的生物安全性的关注度越来越高。天然的黑色素是非均质多 酚类聚合体，以酪氨酸为底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴铬等，而后经过一系列 非酶催化的氧化反应最终生成黑色素。黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我 保护机制有关。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离 子（例如有毒的重金属）、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾 病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性 的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主 要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色 素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶 催化酪氨酸形成的多巴类黑色素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色 素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来 生产黑色素具有巨大的优势。
[0003] Streptomyces kathirae SC-I是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌 株，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CCTCC M 2012432,与国 内外已报道产黑色素链霉菌16Sr RNA进行对比，发现其最高相似度仅为95. 37%，说明 Streptomyces kathirae SC-I是一株新型产黑色素链霉菌，对产黑色素关键酶酪氨酸酶进 行分离纯化获得电泳纯酪氨酸酶，并且通过基因工程手段获得该酪氨酸酶编码基因，与国 内外已报道酪氨酸酶编码基因进行对比，发现其最高相似度仅为75%，说明Sti^ptomy ces kathirae SC-I酪氨酸酶编码基因是一种新型酪氨酸酶，使用变铅青链霉菌验证克隆获得 基因的功能，拓展了微生物生产黑色素资源。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一个新的酪氨酸酶及其基因，该酪氨酸酶基因序列与国内外已报道 的最高相似度仅为75%，其编码氨基酸序列与国内外已报道的最高相似度仅为83%。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] (1)将Streptomyces kathirae SC-1接种于培养基中培养36h，8000g离心收集发 酵液去菌丝体。
[0007] (2)在冰浴的条件下，向发酵液中添加硫酸铵至其饱和度为65%沉淀酪氨酸酶蛋 白，继续搅拌发酵液20分钟后12000g离心Ih后小心弃其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer A重悬酶蛋白。
[0008] (3)步骤（2)的酶蛋白溶液经透析得到蛋白样品溶液，过Q Sephrose FF离子交换 层析柱，先用Buffer A洗脱至无蛋白流出，在用洗脱液Buffer B梯度洗脱，获得高纯度酪 氨酸酶。
[0009] (4)使用MS鉴定并测定纯化酪氨酸酶部分氨基酸序列，根据MS获得的氨基酸序列 设计引物，克隆了部分酪氨酸酶编码基因，其主要特点是：
[0010] 上游引物其基因型为：TCCCCCTCGTTCCTGCCCTGGCACCG ;
[0011] 下游引物其基因型为：GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC ;
[0012] 酪氨酸酶编码基因的PCR扩增条件为：94°C预变性5min ;95°C变性45s，69°C退火 30s，72°C延伸30s，反应25个循环；
[0013] 将PCR扩增之后的产物经过载体连接并送至上海生物工程有限公司测序。
[0014] (5)步骤⑷获得的部分基因序列，设计引物，应用TAIL-PCR扩增已知基因片段两 端序列，其主要特点是：
[0015] 使用SP1-6结合AD引物扩增已知基因片段3'端基因序列，使用SP7-12结合AD 引物扩增已知基因片段5'端基因序列；
【权利要求】
1. 一种Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶的编码基因melC及其蛋白， Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株，目前该菌 株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2012432。
2. 权利要求1所述的链霉菌菌株所产酪氨酸酶的分离纯化方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 将Streptomyces kathirae SC-1接种于培养基中培养36h，8000g离心收集发酵液 去菌丝体； (2) 在冰浴的条件下，向发酵液中添加硫酸铵至其饱和度为65%沉淀酪氨酸酶蛋白， 继续搅拌发酵液20分钟后12000g离心lh后小心弃其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer A 重悬酶蛋白； (3) 步骤⑵的酶蛋白溶液经透析得到蛋白样品溶液，过Q Sephrose FF离子交换层析 柱，先用Buffer A洗脱至无蛋白流出，在用洗脱液Buffer B梯度洗脱，获得高纯度酪氨酸 酶蛋白； 其中所述Buffer A含有pH8. 00. 05M Tris-HCl缓冲液；所述Buffer B含有 pH8. 00. 05MTris-HCl、lMNaCl 缓冲液。
3. 权利要求2所述的酪氨酸酶分离纯化方法获得纯酪氨酸酶部分基因片段扩增引物：TCCCCCTCGITCCTGCCCTGGCACCG 及 GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC 进行 PCR 扩增获得部分 酪氨酸酶基因片段；扩增条件为：94°C预变性5min ;95°C变性45s，69°C退火30s，72°C延伸 30s，反应25个循环，4°C保存。
4. 利用权利要求3所获得的酪氨酸酶基因片段，使用TAIL-PCR获得新的酪氨酸酶全 基因，其特征是包括553bp开放阅读框上游序列、酪氨酸酶操纵子melC (包括两个编码基因 melCl及melC2)，melCl大小为375bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码124个 氨基酸，蛋白大小为12. 9kDa，在32-33处含有信号肽切割位点Ala-Ala，melC2基因产物为 酪氨酸酶，melC2大小为822bp，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码273个氨基酸， 蛋白大小为30. 8kDa，获得的新的酪氨酸酶基因序列与已报道的酪氨酸酶基因序列相似性 最尚为75%。
5. 权利要求4所述的酪氨酸酶基因，其特征在于，将酪氨酸酶编码基因的功能验 证表达质粒PIJ86-C2及pIJ86-melCl-C2通过引物设计melCIF、melC2F及melCR以 Streptomyces kathirae SC-1基因组为模板，PCR扩增目的基因。
6. 权力要求5所述的引物序列及用途，其特征在于， 引 物 me 1C 1 F : CTAAAGCTTATGCCGGAACTCACCCGCCG 及 me 1 CR ： CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC 用于扩增 melCl-C2 串联基因片段；引物 melC2F : CTAAAGCTTATGACCGTACGCAAGAACCAG 及 melCR :CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC 用于扩 增melC2基因片段。
7. 如权利要求5所述的酪氨酸酶基因PCR扩增条件，其特征在于，95°C预变性5min ; 97°C变性45s, 69°C退火30s, 72°C延伸1. 5min，反应25个循环。
8. 如权利要求5所述的酪氨酸酶基因编码的蛋白，其特征在于，melCl基因产物为酪 氨酸酶金属伴侣，其功能为激活酪氨酸酶原，帮助酪氨酸酶至细胞外；melC2基因产物为酪 氨酸酶，获得的新的酪氨酸酶氨基酸序列与已报道的酪氨酸酶氨基酸序列相似性最高为 83%。
【文档编号】C12N15/53GK104404064SQ201410749427
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】饶志明, 郭静, 杨套伟, 徐美娟, 张显, 满在伟 申请人:江南大学