一株高产碱性木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明目的是提供一种高产碱性木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母突变菌株，是由构建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌经紫外诱变获得的，该菌株已于2014年12月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014624。该突变菌株的发酵上清液酶活高达6982U/mL，比出发菌提高了88％，且突变菌株重组表达的木聚糖酶的酶学性质并未因突变发生变化，与出发菌几乎相同。该突变菌株重组表达的木聚糖酶在碱性条件下具有很高的活性，可广泛应用于造纸领域。
CCTCC NO：M2014624
20141204
【专利说明】一株高产碱性木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能微生物菌株筛选【技术领域】，具体涉及一株高产碱性木聚糖酶的巴 斯德毕赤酵母及其应用。
【背景技术】
[0002] 木聚糖（xylan)是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量仅次 于纤维素是第二丰富的多聚糖。木聚糖酶（Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为 低聚木糖和木糖的一组酶的总称。目前木聚糖酶在饲料、烘焙、啤酒、造纸、纺织、医药及能 源等领域得到了日益广泛的应用。在造纸工业中，木聚糖酶可以应用于生物制浆、纸浆漂 白、废纸脱墨处理等，特别是其在纸浆生物漂白中，木聚糖酶与传统的氯漂白配合，促使纸 浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性， 改善纤维的滤水性和造纸性能，而且可以降低后续工艺化学物质的用量，减少富含氯化物 的工业废水的排放，从而降低纸浆漂白对环境产生的污染。
[0003] 目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆漂白已经成为世界各国造纸业 纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂 得到应用，丹麦诺维信公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆漂白的木聚糖酶 和纤维素酶新产品。但目前为止，工业上用的木聚糖酶主要来自细菌和真菌，报道较多及产 酶活力较高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它们所产的酶大多为中性偏酸的 木聚糖酶，最适反应温度大多在50°C以下。而在造纸工业中，纸浆蒸煮和漂白工艺基本都是 在高温和强碱的条件下进行，使得现有的酸性或中性木聚糖酶产品受到了极大的限制。因 此，研究开发具有优良特性的碱性木聚糖酶具有重大经济效益和社会效益，具有更广的应 用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高产碱性木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母突变菌株，是由构 建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌经紫外诱变获得的，其能大幅度提高碱性木聚糖酶的表达 量，且不影响碱性木聚糖酶的酶学性质和应用效果。
[0005] 本发明一方面提供了一株突变菌株巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)XynHl，该 菌株已于2014年12月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编 号为 CCTCC NO :M2014624。
[0006] 上述的巴斯德毕赤酵母XynHl是通过紫外诱变获得的。
[0007] 本发明另一方面提供上述巴斯德毕赤酵母XynHl在碱性木聚糖酶生产中的应用。
[0008] 在发酵罐上进行巴斯德毕赤酵母XynHl和巴斯德毕赤酵母XD的发酵，发酵使用的 培养基配方为：硫酸钙1. lg/L、磷酸二氢钾5. 5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20. 3g/L、硫 酸镁16. 4g/L、氢氧化钾1. 65g/L、消泡剂0? 05%。
[0009] 发酵生产工艺：pH值5.0、温度25°C、搅拌速率300rpm、通风量1.0-L5(V/v)、溶 氧控制在20%以上。
[0010] 本发明通过紫外诱变的方法获得一株突变菌株巴斯德毕赤酵母XynHl，其发酵上 清液酶活高达6982U/mL，比出发菌提高了 88%，且突变菌株重组表达的木聚糖酶的酶学性 质并未因突变发生变化，与出发菌几乎相同。该巴斯德毕赤酵母XynHl突变菌株重组表达 的木聚糖酶在碱性条件下具有很高的活性，可广泛应用于造纸领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 : SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0012] 其中，泳道1为宿主菌巴斯德毕赤酵母发酵上清液，泳道2为阳性转化子发酵上清 液，箭头所指20kD附近可以看到清晰的蛋白条带，即为重组表达的木聚糖酶。
[0013] 图2 :突变菌与出发菌发酵上清液中木聚糖酶相对酶活-pH变化曲线。
[0014] 图3 :突变菌与出发菌发酵上清液中木聚糖酶相对酶活-温度变化曲线。
[0015] 图4 :突变菌与出发菌发酵罐发酵进程曲线。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例 更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案 例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范 围。
[0017] 实施例1:出发菌株的构建
[0018] 根据NCBI公布的来源于拟青霉（Paecilomyces. sp)的木聚糖酶基因（GeneBank ACS26244. 1)，根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，并在其起始密码子ATG 前增加6个碱基GAATTC (EcoR I酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC (Not I 酶切位点），并由上海捷瑞公司合成，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0019] 用限制性内切酶EcoR I和Not I(Fermentas)对木聚糖酶基因进行酶切；同时， 用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切 产物纯化，并用T4DNA连接酶（Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进 Trans5 a大肠杆菌（Transgen)，用氨节青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测 序（Invitrogen)〇
[0020] 使用质粒小量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列中插入了目的片段SEQ ID N0:2,其 编码的蛋白序列为SEQ ID NO: 1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pPIC9K-XD。
[0021] 重组酵母表达质粒PPIC9K-XD用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电 穿孔法转化巴斯德毕赤酵母GS115,在MD平板上筛选得到巴斯德毕赤酵母重组菌株GS115/ PPIC9K-XD，再在含不同浓度遗传霉素的YH)平板上筛选多拷贝的转化子。
[0022] 挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30°C 250rpm振荡培养Id后，再转入 BMM培养基中30°C 250rpm振荡培养，每天添加0. 5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌 体，将上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示：与1号泳道的宿主菌发酵上清液 相比，2号泳道的阳性转化子发酵上清液在20kDa处多出一条明显的蛋白条带，与本发明所 述来源于拟青霉的木聚糖酶的理论分子量大小一致，从而说明本发明构建得到的巴斯德毕 赤酵母工程菌能体外表达来源于拟青霉的木聚糖酶。将该阳性转化子命名为巴斯德毕赤酵 母 XD(Pichia pastoris XD)。
[0023] 1、木聚糖酶酶活单位的定义
[0024] 在50°C、pH值为8. 0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放 1 U mol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0025] 2、测定方法
[0026] 取2ml浓度为1 %的木聚糖底物（pH8. 0磷酸氢二钠-柠檬酸配制），加入到比色 管中，50°C平衡lOmin，再加入2ml经pH8. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释并经50°C 平衡好的碱性木聚糖酶酶液，混匀于50°C精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS 试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，混 匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值A e。
[0027] 酶活计算公式：
【权利要求】
1. 一种巴斯德毕赤酵母，其特征在于，所述的巴斯德毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO: M2014624。
2. 权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母，其特征在于，所述的巴斯德毕赤酵母是通过紫 外诱变获得的。
3. 权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母在碱性木聚糖酶生产中的应用。
4. 一种生产碱性木聚糖酶的方法，其特征在于，所述的方法，是用权利要求1所述的巴 斯德毕赤酵母发酵制备碱性木聚糖酶。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵使用的培养基配方为硫酸钙 1. lg/L、磷酸二氢钾5. 5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20. 3g/L、硫酸镁16. 4g/L、氢氧化钾 1. 65g/L、消泡剂 0? 05%。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵生产工艺如下：pH值5. 0、温度 25°C、搅拌速率300rpm、通风量1. 0-1. 5(v/v)、溶氧控制在20%以上。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的碱性木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
【文档编号】C12R1/84GK104450542SQ201410753232
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】徐晓东, 李冬冬, 肖志壮, 王海 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 潍坊康地恩生物科技有限公司