一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法

一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，提取金花茶中的黄酮类物质，以作用于体外培养的CNE-1、CNE-2、C666-1等鼻咽癌细胞株为模型，应用激光共聚焦倒置显微镜、荧光标记mRNA差异显示技术、蛋白组学方法及基质辅助飞行时间质谱等技术，发现金花茶提取物中黄酮类类物质可抑制鼻咽癌癌细胞增殖、并诱导其凋亡，并定位检测bcl-2、notch1等基因在鼻咽癌中的表达，从蛋白水平的变化揭示了金花茶中黄酮类物质抑制鼻咽癌活性的有效位点。本发明还可以通过差异表达的蛋白进行深入研究，阐明其作用的机制，同时这些蛋白有可能作为临床上治疗鼻咽癌药物作用的靶分子。
【专利说明】一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方 法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体是一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位 点筛选方法，是以作用于体外培养的鼻咽癌细胞株为模型，通过差异显示反转录聚合酶链 式反应技术（DDRT-PCR)、蛋白组学方法等技术，观察金花茶提取物中黄酮类物质抑制鼻咽 癌细胞增殖、诱导凋亡及蛋白变化水平效果，经数据库检索匹配，筛选出外源性金花茶中黄 酮类物质对鼻咽癌作用的有效位点。

【背景技术】
[0002] 金花茶属于山茶科、山茶属，是我国八种国家一级保护植物之一，《本草纲目》有 载："山茶产南方……，又有一捻红，千叶红、千叶白等名，或云亦有黄色者";广西《地方志》 亦有记载："金花茶，常绿灌木，生长在荒山野岭中"，被誉为"植物界大熊猫"、"茶族皇后"。 卫生部2010年第9号文件，批准金花茶、酵母β -葡聚糖、雪莲培养物等5种物品为新资源 食品。研究发现，金花茶叶和花中富含总黄酮（异黄酮、双黄酮、花色苷及新黄酮类等）、茶 多酚，茶多糖、挥发性精油、多种氨基酸等。
[0003] 张睿等在黄酮类化合物提取工艺研究中指出黄酮类化合物是广泛存在于自然界 的一大类化合物，包括黄酮、黄烧醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、噢弄、黄烧酮、花色素、 查耳酮、色原酮等，现已发现约4000余种黄酮类化合物，主要存在于植物的叶、果实、根、皮 中，实验证明其具有广泛的生理和药理活性(包括抗氧化，清除氧自由基、抗病毒、抗癌、抗 炎、抗衰老等)，因此对该化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门话题。
[0004] 目前尚较少文献涉及金花茶中黄酮类物质在抑制鼻咽癌的分子生物学或流行病 学等相关报道。少量文献涉及较为笼统的概念，如金花茶醇提物或水提物抗肿瘤活性等，但 由于被研究对象成分非常复杂，较难确定真正抑瘤活性成分，以及相关有效作用位点。现有 相关文献如：朱华等在金花茶醇提物对人低分化鼻咽癌CNE-2细胞增殖和周期的影响中将 人鼻咽癌CNE-2细胞分为两组，实验组加入终浓度为25、50、100、200、400 μ g/mL的金花茶 醇提物，对照组不加药物，采用MTT法检测两组24、48、72 h增殖抑制率，倒置相差显微 镜及荧光显微镜观察48h后细胞形态的变化，流式细胞仪分析细胞周期变化及凋亡率。结 果显示金花茶醇提物对CNE-2细胞的增殖有抑制作用。农彩丽等在金花茶总黄酮体外抗肿 瘤活性的实验研究中采用噻唑蓝染色法(MTF法)检测金花茶总黄酮在体外对人肝癌细胞株 (SMMC-7721)、人高分化鼻咽癌细胞株（CNE-1)、人胃腺癌细胞株（SGC-7901)、人大细胞肺 癌细胞株（H460)的增殖抑制率，并计算相应的半数生长抑制浓度（IC50)。结果金花茶总黄 酮对SMMC-7721、CNE-1、SGC-7901、H460均有抑制作用（P〈0· 05)，且呈一定的浓度依赖性， IC50 分别为 242. 44 μ g/mL、313. 79 μ g/mL、259. 87 μ g/mL、385. 87 μ g/mL。韦锦斌等在金花 茶体外抗肿瘤活性及物质基础的初步研究中检测金花茶不同萃取部位体外对人胃腺癌细 胞株（SGC-7901)、人大细胞肺癌细胞株（H460)、人肝癌细胞株（SMMC-7721和BEL-7404)、人 高分化鼻咽癌细胞株（CNE-I)作用48 h后的增殖抑制率，并计算相应的半数生长抑制浓 度（IC50)，水层部位对上述5种细胞株的IC50分别为：8L 72, 73. 47, 95. 98, 73. 41，6L 25 mg *L-1;水层萃取部分检测到的物质有24个，初步鉴定了其中的11个成分。作者研究结 论为金花茶不同萃取部位体外实验有抗肿瘤活性，水层部分可能是金花茶抗肿瘤作用的 主要活性部位；需要进一步对水层部分的这些可能活性物质进行分离纯化鉴定以及定量分 析；也有作者研究了非金花茶黄酮成分抑制鼻咽癌活性研究，如韩宏裕等探讨了染料木黄 酮对未分化鼻咽癌细胞的增殖抑制作用。采用MTT法检测染料木黄酮对未分化鼻咽癌细胞 株生长的影响，采用流式细胞术检测染料木黄酮作用于未分化鼻咽癌细胞株后细胞周期的 变化。结果显示染料木黄酮对不同的未分化鼻咽癌细胞株CNE-2和C666-1均具有增殖抑 制作用，作用方式呈时间一剂量一效应关系。专利200710066974. X :"邻-二羟基黄酮-硒 配合物制备方法及医学用途"制备了一类芦丁-硒配合物，并开展了其对鼻咽癌细胞CNE2 体外抑制试验，得到一组实验数据。
[0005] 聚酰胺-胺型树状大分子具有丰富的端氨基结构及内部仲、季胺结构，使整体聚 酰胺-胺型树状大分子呈弱碱性。黄酮类化合物大多具有酚羟基，整体呈弱酸性，呈弱碱 性的PAMM树状大分子材料对呈弱酸性的黄酮类物质有较强的萃取吸附作用。为更好地对 PAMAM吸附后的黄酮类物质进行分离，本发明将PAMAM与磁性纳米粒子四氧化三铁、γ -三 氧化铁、Fe2N等复合制备磁性粒子-PAMM纳米复合材料，通过磁性作用将萃取吸附有弱酸 性黄酮物质的磁性粒子-PAMM纳米复合材料从萃取液中分离。
[0006] 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC)是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性 肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。常见临床症状为鼻塞、 涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。鼻咽癌曾被称为广东瘤（Canton tumor)，主 要发生于我国南方五省，即广东、广西、湖南、福建和江西，占当地头颈部恶性肿瘤的首位。 东南亚国家也是高发区。据世界卫生组织估计，全球约80%的鼻咽癌发生在中国。发病率 男性达30/10万以上，女性也超过15/10万以上。分子遗传学研究发现，鼻咽癌肿瘤细胞发 生染色体变化的主要是1、3、11、12和17号染色体，在鼻咽癌肿瘤细胞中发现多染色体杂合 性缺失区（lp、9p、9q、llq、13q、14q和16q)可能提示鼻咽癌发生发展过程中存在多个肿瘤 抑癌基因的变异。
[0007] 肿瘤细胞的增殖与凋亡和所涉及的重要基因以及蛋白的表达异常、癌基因的激活 或抑癌基因的突变缺失、DNA损伤修复基因的突变以及细胞信号转导异常等，是介导肿瘤发 生、发展的重要分子基础。对于黄酮类物质的研究表明，它们的抗氧化和对致癌物的清除， 可能涉及肿瘤发生的分子事件，影响到肿瘤的启动、促进和进展各个阶段。因此，对金花茶 中黄酮类物质抗肿瘤作用从细胞水平、基因和蛋白质表达水平进行深入研究和探讨，可能 为抗肿瘤作用分子机制的深入阐明，提供新的线索。现有文献研究较为笼统(醇提物或水提 物)，被研究对象成分非常复杂，较难确定真正抑瘤活性成分，以及相关有效作用位点。需要 进一步对水层部分的这些可能活性物质进行分离纯化鉴定以及定量分析。


【发明内容】

[0008] 本发明的目的在于提供一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选 方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，具体步骤包括： 1) 金花茶中的黄酮类物质的提取 金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，筛选、洗净、粉碎，将粉碎后的金 花茶花朵8-12公斤；加入95%以上的乙醇20L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提 取后残渣加入95%以上的丙酮13-17L，在40-60°C条件下超声l_2h，得提取液B，合并提取 液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓缩液 0. 5-1. 5L ； 四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，p H= 1. 7时，制备 0· 085mol/L的三氯化铁溶液和0· 05mol/L的硫酸亚铁的混合物；往此混合物中滴加 1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9;所获得的四氧化三铁磁粒子立即用水洗 涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得浓度为 0. 0128mol/L ;上述制备的25mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并 超声处理30min ;然后加入IOmL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h ;所得 溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用；取50mL的5wt % 的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯 酸甲酯的体积浓度为20%，把此混合液在室温水浴中超声7h ;然后用磁铁收集磁性纳米 粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入 40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50%，室温下超声处理3h ;然后用甲醇 洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循 环四次得到四代树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子；此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用 25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子，即四氧化三铁 磁粒子-PAMM复合材料； 将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料4-6g加入到第一步制备好的 0. 5-1. 5L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取lh，萃取结束后通过磁分离手段将 吸附萃取黄酮类物质的四氧化三铁磁粒子-PAMM复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物 质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料采用有机溶剂乙醇萃取3-5次，合并萃取液，旋转 蒸发得到金花茶中的黄酮类物质； 2) 体外培养的鼻咽癌细胞 CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F 和 6-10B， 上述细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37°C、5%的CO2、饱和湿度下传代培养， 实验分组：黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮组中黄酮各剂量 组分别为10、20、30、50和90 μ mol/L ;阳性对照组顺钼用药剂量为0· 25 μ mol/L ;溶剂对照 组加入终浓度为〇. 1 %的DMSO ;空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞； 3) 检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的作用 a)采用MTT法检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，用流式细胞仪分析细 胞周期，具体步骤包括取对数生长期CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和 6-10B中的一种或两种以上，经质量百分比浓度为0. 25%的胰酶消化，接种于96孔培养板 内，5 X IO3个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度 的各种受试物，总体积200 μ 1/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96 h， 每孔加入20 μ 1浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200 μ 1的DMS0,平 板摇床摇震lOmin，以DMSO调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算 平均A值、增殖率PR及抑制率CIR ;增殖率PR=(实验组A值/溶剂对照组A值）X 100% ;抑 制率CIR=(1-试验组平均A值/对照组平均A值）X 100% ;运用曲线回归分析，求出剂量反 应关系方程及回归系数； b) 根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞。取对数生长期的 鼻咽癌细胞，调整密度2. 5 X IO4个/mL，置28cm 2培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后加入 不同浓度处理因素，于96h终止培养；取步骤a)中的细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为 0. 25%的胰酶消化，2000r/min离心lOmin，弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS液中，调整细 胞密度至IXlO6个/ml，2000r/min离心lOmin，弃上清液；快速加入4°C预冷的75%乙醇 lml，使细胞重悬，4°C下保温10_15h ;取单细胞悬液lml，加入IOy g/ml的荧光染料碘化丙 啶10 μ 1和10mg/ml的RNA抑制剂5 μ 1，轻微振荡、室温下避光孵育20min，以400目筛网 过滤，取细胞悬液在488nm波长下，用流式细胞仪进行细胞DNA含量检测；经Muticycle AV 软件处理获取数据，对细胞周期各时相分布百分比进行分析，计算细胞周期中GtZG1期、S期 和G 2/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数PI表示细胞的增殖活性； c) 采用荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内，5 X IO3个细 胞/孔，预培养24h，各实验组分别加入10、20、30、50、90 μ mol/L的金花茶黄酮类物质活性 提取物，于溶剂对照组、顺钼组分别培养24、48、72和96h，苏木精-伊红染色法染色涂片后 于荧光倒置显微镜下观察； d) 应用免疫组化、Real-time荧光定量RT-PCR、Westem-blot分析癌细胞中蛋白表达变 化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80 μ mol/L的黄酮物质作用24h 后，每5-10 X IO6细胞，加 ImL的Trizol试剂，15-30°C作用15min，弃上清液，向沉淀物中加 0· 5ml 异丙醇 /ml Trizol 试剂，15-3CTC作用 lOmin，2_8°C，12000 转离心 15min，弃上清液； 再加入Iml的75%乙醇/mlTrizol试剂洗涤RNA，2-8°C，7500转离心5min，弃上清液，得到 的样品于_80°C下保存； 使用ABI/9700系统进行各基因 PCR扩增反应，反应程序如下：95°C，10s ;预变性： 95°C，5s ;60°C，34s ;40个循环；各种基因的PCR反应均进行扩增产物的熔解曲线分析， 后续采用Western-Blot分析鼻咽癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔 细胞培养板中，培养24h，经80 μ mol/L的金花茶黄酮物质作用24h后，PBS液洗涤三次，力口 入冷的细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4°C，14000转离心15min，吸 取上清液，紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致；样品经10-12%聚丙 烯酰氨凝胶电泳4h后，转印到硝酸纤维素膜上，100mA、20-60min ;硝酸纤维素膜经封闭液 封闭3h后，TBS缓冲液洗涤三次，于稀释比例1:500-1:2000的第一抗体工作液中孵育2h ; TBS缓冲液洗涤3次，稀释比1:2000的辣根过氧物酶标记的第二抗体工作液孵育2h，TBS缓 冲液洗涤3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，β-actin蛋白作为内参蛋白； 4) 采用SPSS 12. 0统计软件对结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析； 两两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准α =〇. 05， 5) 检测黄酮物质作用鼻咽癌细胞后的差异表达蛋白，获得双向电泳差异表达图谱， 鉴定差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库匹配，筛选出相关蛋白，所述相关蛋白包括bcl-2， notchl, nm23_Hl, bax 和 E-cadherin〇
[0010] 作为本发明进一步的方案：RPMI 1640培养基中含10%标准胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μ g/ml链霉素。
[0011] 作为本发明进一步的方案：聚丙烯酰氨凝胶电泳中浓缩胶80V、分离胶120V。
[0012] 作为本发明进一步的方案：封闭液包括5%脱脂乳与0· 05% Tween 20, ρΗ7· 6。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中相关蛋白表达的变化提示金花 茶中黄酮物质活性成分可作用于细胞代谢、信号转导、氧化应激等多种途径，使对其多途径 作用的机制有了较为深入地了解。从蛋白水平的变化揭示了黄酮物质作用的位点，这些差 异表达的蛋白可以作为源自金花茶的黄酮物质作用的标志物分子，通过对它们的深入研究 可以更加清楚的阐明其作用的机制，同时这些蛋白有可能作为临床上治疗鼻咽癌药物作用 的革巴分子。

【专利附图】

【附图说明】
[0014] 图1为四氧化三铁磁粒子-PAMM复合材料合成及分离黄酮类物质示意图。
[0015] 图2为金花茶黄酮物质50ymol/L组不同时间细胞形态示意图，倒置显微 镜X400 ;a :空白对照72h。
[0016] 图3为金花茶黄酮物质50 μ mol/L组不同时间细胞形态示意图，倒置显微 镜X400 ;b :黄酮处理组48h。
[0017] 图4为金花茶黄酮物质50ymol/L组不同时间细胞形态示意图，倒置显微 镜X400 ;c:黄酮处理组72h。
[0018] 图5为Western-Blot检测金花茶黄酮物质诱导48 h后CNE-I细胞质中Bcl-2和 Bax蛋白含量的变化；β -actin为内参蛋白。

【具体实施方式】
[0019] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0020] 实施例1 金花茶叶浓缩液制备：采摘春季新鲜的金花原叶，经筛选，洗净、粉碎等工序，将粉碎后 的金花茶原叶20公斤；加入乙醇（95%以上)55L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提 取后残渣加入45L左右丙酮（95%以上)，在40-60°C条件下超声约I. 5h，得提取液B，合并提 取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶浓缩液约 2. OL0
[0021] 四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，pHl. 7时，制备三 氯化铁溶液（0.085 mol/L)和硫酸亚铁（0.05 mol/L)的混合物。然后，往此混合物中滴 加1.5 mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9。所获得的四氧化三铁磁粒子立即用水 洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得浓度为 0.0128 mol/L。上述制备的25 mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL， 并超声处理30 min。然后加入IOmL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。 所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用。50mL的5wt % 的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液，以此作为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸 甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室温水浴中超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗 粒，然后用甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL 的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进 行磁分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代树形分子 修饰的四氧化三铁磁粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收 集获得PAMM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子。
[0022] 金花茶中黄酮物质萃取分离：将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMM复合材料 适量IOg加入到第一步制备好的2. OL金花茶叶萃取液中，在400W条件下超声萃取一定时 间lh，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质（弱酸性）的四氧化三铁磁粒 子-PAMM复合材料分离，分离后的的四氧化三铁磁粒子-PAMM复合材料（吸附有黄酮物 质）采用有机溶剂乙醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发得到金花茶中的黄酮类物质，四氧 化三铁磁粒子-PAMM复合材料则洗涤多次干燥活化后重新使用。
[0023] 人鼻咽癌细胞CNE-I体外培养：鼻咽癌细胞CNE-I由广东省人民医院提供，该细胞 均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37°C、5%的CO2、饱和湿度下常规传代培养，3天传代 一次。
[0024] 实验分组：实验分为黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮各 剂量组分别为10、20、30、50和90 μ mol/L ;阳性对照组顺钼用药剂量为0· 25 μ mol/L ;溶剂 对照组加入终浓度为〇. 1 %的DMS0。空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞。
[0025] MTT法检测黄酮物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，具体步骤包括取对数生长期 CNE-I，经0. 25% (g/v)胰酶消化，接种于96孔培养板内，5 X IO3个细胞/孔，预培养24h，待 细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物（总体积200 μ 1/孔）， 每一剂量组设4个复孔。分别培养24、48、72和96h，每孔加入20 μ 1浓度为5mg/L的ΜΤΤ， 继续培养4h，弃去培养液，每孔加200 μ 1的DMS0,平板摇床摇震lOmin，以DMSO调零，用 酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值、增殖率（proliferation rate, PR)及抑制率（cell inhibitory rate, CIR)。增殖率PR=(实验组A值/溶剂对照 组A值）X 100% ;抑制率CIR= (1-试验组平均A值/对照组平均A值）X 100%。运用曲线 回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数。
[0026] 流式细胞仪监测凋亡及细胞周期：根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照 实验设计处理细胞。取对数生长期的CNE-I鼻咽癌细胞，调整密度2. 5 X IO4个/mL，置28cm2 培养瓶中，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养。取CNE-I细 胞，弃去培养液，0. 25 %的胰酶消化，2000r/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀重悬于PBS 液中，调整细胞密度至IX IO6个/ml，离心，弃上清。快速加入4°C预冷的75%乙醇I mL， 使细胞重悬，4°C过夜。取单细胞悬液I mL加入10 μ g/mL的荧光染料碘化丙啶PIlO μ 1和 10mg/mL的RNA抑制剂5 μ 1，轻微振荡、室温下避光孵育20 min，以400目筛网过滤，取适量 细胞悬液在488 nm波长下，采用流式细胞仪检测细胞的DNA含量，每个样品至少有I X IO5 个细胞，经Muticycle System处理获取数据,对细胞周期各时相分布百分比进行分析,计算 细胞周期中Go/Gl期、S期和G2/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数（PI)表示细 胞的增殖活性。
[0027] 荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内，5X IO3个细胞 /孔，预培养24h，各实验组分别加入10、20、30、50、90 μ mol/L的金花茶黄酮物质活性提取 物，与溶剂对照组、顺钼组分别培养24、48、72和96h，于Olympus IX-71荧光倒置显微镜下 观察。如本发明所述，黄酮物质诱导CNE-I细胞分化后，细胞会出现扁平化，体积增大，细胞 密度降低，核外形规整，核/浆比减小等与细胞分化相关的典型形态学特征。
[0028] Real-time荧光定量RT-PCR分析癌细胞中蛋白表达变化：两株鼻咽癌细胞接种于 6孔细胞培养板中，培养24h，经80 μ mol/L的黄酮物质作用24h后，每5-10 X IO6细胞，加 ImL Trizol试剂，15-30 °C作用15min，吸无色上清液，加0.5mL异丙醇/mL Trizol试剂， 15-30°C作用 10min，2-8°C，12000 转离心 15min，加入 I mL 75% 乙醇 /mL Trizol 试剂洗涤 RNA，2-8°C，7500转离心5min，样品保存于-80°C。使用ABI/9700系统进行各基因 PCR扩 增反应，反应程序如下：95°C，10s ;预变性：95°C，5s ;60°C，34s ;40个循环。各种基因的PCR 反应均进行扩增产物的熔解曲线分析，以确定各扩增产物的特异性和纯度。
[0029] Western-Blot分析鼻咽癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞 培养板中，培养24h，经80 μ mol/L的黄酮物质作用24h后，PBS液洗涤三次，加入冷的细胞 裂解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4°C，14000转离心15min，吸取上清液， 紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致。样品经10-12%聚丙烯酰氨凝胶 电泳4h后，转印到硝酸纤维素膜上，100mA，20-60min。硝酸纤维素膜经封闭液封闭3h后， TBS缓冲液洗涤三次，于第一抗体工作液(稀释比例1:500-1:2000)中孵育2h。TBS缓冲液 洗涤3次，辣根过氧物酶标记的第二抗体工作也(稀释比1:2000)孵育2h，TBS缓冲液洗涤 3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，β -actin蛋白作为内参蛋白。
[0030] SPSS 12. 0统计软件对结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析；两 两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准α =〇.〇5,应用美国 GraphPad Software 公司的 Graph-Pad Prism 5. 0 软件计算半数抑制量（IC50)。
[0031] 与黄酮物质抑制鼻咽癌效应相关的有效位点筛选：采用DDRT-PCR技术对黄酮物 质作用于鼻咽癌细胞后的实验组及对照组差异表达基因进行检测，主要步骤包括：继续培 养48h，分别提取mRNA，并进行mRNA完整性鉴定，用锚定引物反转录成cDNA，并进行PCR扩 增；上游引物为随机引物，下游引物为与逆转录引物系列相同的带荧光物质标记的锚定引 物，进行DDRT-PCR反应，通过变性聚丙烯酰胺电泳及分离差异显示片段，通过图像分析、差 异条带回收、差异条带再扩增等技术实现差异显示片段的克隆及序列分析。
[0032] 通过上述技术获得了差异表达指纹图谱；采用蛋白质组学技术检测黄酮物质作 用后的差异表达蛋白，获得差异表达蛋白的双向凝胶电泳图谱。随后用基质辅助激光解吸 附电离飞行时间质谱（MALDI-T0F-MS)鉴定一系列差异蛋白的肽指纹图谱，主要实验设计 如下：基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪为Bruker公司的Autoflex，将样品溶于 0. 1%三氟乙酸中，取1μ 1与饱和CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液，a-CCA)基质上 清液混合，取1μ 1点在Sc〇rCe384靶上，待挥发结晶后，送入离子源中进行检测。采用反 射检测方式；胰酶切；波长337nm :混合肽标准对仪器进行校正。通过MALDI-T0F-MS质谱 分析，测定胶内酶切后多肽混合物的质量，获得检测样品的肽质量指纹图谱。选择拟查询 的物种，肽质量指纹谱数据及其它参数，使用http://www. Matrixscience. com网站提供的 Mascot:Peptide Mass Fingerprint蛋白数据库检索程序，在NCBInr蛋白质数据库搜索理 论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白。经数据库检索匹配，从细胞代谢、信号转导，细胞骨架 组成、氧化应激、免疫、细胞增殖和凋亡等各角度筛选出了一些相关蛋白，如bcl-2，bax等。
[0033] 实施例2 金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，经筛选，洗净、粉碎等工序，将粉碎 后的金花茶花朵10公斤；加入乙醇（95%以上)20L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ; 提取后残渣加入15L左右丙酮（95%以上)，在40-60°C条件下超声约I. 5h，得提取液B，合并 提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓 缩液约I. OL。
[0034] 四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，pHl. 7时，制备三 氯化铁溶液（0.085 mol/L)和硫酸亚铁（0.05 mol/L)的混合物。然后，往此混合物中滴加 I. 5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9。所获得的四氧化三铁磁粒子立即用水洗涤5 次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得浓度为0. 0128 mol/L。上述制备的25 mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声 处理30 min。然后加入IOmL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h。所得溶 液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用。50mL的5 wt %的四 氧化三铁磁粒子甲醇溶液，以此作为起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯 的甲醇溶液，把此混合液浸入到室温水浴中超声处理7h。然后用磁铁收集这些纳米颗粒， 然后用甲醇洗涤5次，并磁分离。在洗涤之后，往此磁性纳米颗粒的甲醇溶液加入40mL的 50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室温下超声处理3h。用甲醇洗涤此纳米粒子5次，并进行磁 分离。不断重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代树形分子修饰 的四氧化三铁磁粒子。此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获 得PAMM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子。
[0035] 金花茶中黄酮物质萃取分离：将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料 适量5g加入到第一步制备好的I. OL金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取一定 时间lh，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质（弱酸性）的四氧化三铁磁粒 子-PAMM复合材料分离，分离后的的四氧化三铁磁粒子-PAMM复合材料（吸附有黄酮物 质）采用有机溶剂乙醇萃取多次，合并萃取液，旋转蒸发得到金花茶中的黄酮类物质。
[0036] 人鼻咽癌细胞CNE-2体外培养：鼻咽癌细胞CNE-2由上海生工生物工程有限公司 提供，该细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37°C、5%的C02、饱和湿度下常规传代 培养，3天传代一次。
[0037] 实验分组：实验分为黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮各 剂量组分别为10、20、30、50和90 μ mol/L ;阳性对照组顺钼用药剂量为0· 25 μ mol/L ;溶剂 对照组加入终浓度为〇. 1 %的DMS0。空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞。
[0038] MTT法检测黄酮物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，具体步骤包括取对数生长期 CNE-2,经0. 25% (g/v)胰酶消化，接种于96孔培养板内，5 X IO3个细胞/孔，预培养24h，待 细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物（总体积200 μ 1/孔）， 每一剂量组设4个复孔。分别培养24、48、72和96 h，每孔加入20μ 1浓度为5mg/L的ΜΤΤ， 继续培养4h，弃去培养液，每孔加 DMSO 200 μ 1，平板摇床摇震10min，以DMSO调零，用酶联 免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值和增殖率PR及抑制率CIR。增 殖率PR=(实验组A值/溶剂对照组A值）X 100% ;抑制率CIR= (1-试验组平均A值/对照 组平均A值）X 100%。运用曲线回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数。
[0039] 流式细胞仪监测凋亡及细胞周期：根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照 实验设计处理细胞。取对数生长期的CNE-2鼻咽癌细胞，调整密度2. 5 X IO4个/mL，置28cm2 培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养。取CNE-2细 胞，弃去培养液，0. 25 %的胰酶消化，2000r/min离心lOmin，弃上清，将细胞沉淀重悬于PBS 液中，调整细胞密度至IX IO6个/ml，离心，弃上清。快速加入4°C预冷的75%乙醇lmL，使 细胞重悬，4°C过夜。取单细胞悬液I mL加入10 μ g/mL的荧光染料碘化丙啶（PI) 10 μ 1 和IOmg/ mL的RNA抑制剂5 μ 1，轻微振荡、室温下避光孵育20 min，以400目筛网过滤， 取适量细胞悬液在488 nm波长下，采用流式细胞仪检测细胞的DNA含量，每个样品至少有 IXlO5个细胞,经Muticycle System处理获取数据,对细胞周期各时相分布百分比进行分 析，计算细胞周期中Go/Gl期、S期和G2/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数（PI) 表示细胞的增殖活性。
[0040] 荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内（5X IO3个细胞 /孔)，预培养24h，各实验组分别加入10、20、30、50、90 μ mol/L的金花茶黄酮物质活性提取 物，与溶剂对照组（〇. 1%DMS0)、顺钼组（0. 25mg/mL)分别培养24、48、72和96h，于Olympus IX-71荧光倒置显微镜下观察。如本发明所述，黄酮物质诱导CNE-2细胞分化后，细胞会出 现扁平化，体积增大，细胞密度降低，核外形规整，核/浆比减小等与细胞分化相关的典型 形态学特征。
[0041] Real-time荧光定量RT-PCR分析癌细胞中蛋白表达变化：两株鼻咽癌细胞接种于 6孔细胞培养板中，培养24h，经黄酮物质（80 μ mol/L)作用24h后，每5-10X IO6细胞，加 ImL Trizol试剂，15-30 °C作用15min，吸无色上清液，加0.5mL异丙醇/mL Trizol试剂， 15-30 °C作用 10min，2-8°C，12000 转离心 15min，加入 ImL 75% 乙醇 /mL Trizol 试剂洗涤 RNA，2-8°C，7500转离心5min，样品保存于-80 °C。使用ABI/9700系统进行各基因 PCR扩 增反应，反应程序如下：95 °C，10s;预变性：：95 °C，5s; :60 °C，34s;40个循环。各种基 因的PCR反应均进行扩增产物的熔解曲线分析，以确定各扩增产物的特异性和纯度。
[0042] Western-Blot分析鼻咽癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞 培养板中，培养24h，经黄酮物质（80 μ mol/L)作用24h后，PBS液洗涤三次，加入冷的细胞裂 解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4°C，14000转离心15min，吸取上清液，紫 外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致。样品经10-12%聚丙烯酰氨凝胶电 泳(浓缩胶80V，分离胶120V) 4h后，转印到硝酸纤维素膜上（100mA，20-60min)。硝酸纤维 素膜经封闭液（5%脱脂乳，0.05% Tween 20，ρΗ7·6)封闭3h后，TBS缓冲液（市售，20mmol/ L，pH 7.6)洗涤三次，于第一抗体工作液(稀释比例1:500-1:2000)中孵育2h。TBS缓冲液 洗涤3次，辣根过氧物酶标记的第二抗体工作也(稀释比1:2000)孵育2h，TBS缓冲液洗涤 3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，β -actin蛋白作为内参蛋白。
[0043] SPSS 12. 0统计软件对结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析；两 两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准α =〇.〇5,应用美国 GraphPad Software 公司的 Graph-Pad Prism 5. 0 软件计算半数抑制量（IC50)。
[0044] 表1金花茶中黄酮物质处理CNE-2细胞后各周期的分布（%)

【权利要求】
1. 一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其特征在于，具体步 骤包括： 1) 金花茶中的黄酮类物质的提取 金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，筛选、洗净、粉碎，将粉碎后的金 花茶花朵8-12公斤；加入95%以上的乙醇20L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提 取后残渣加入95%以上的丙酮13-17L，在40-60°C条件下超声l_2h，得提取液B，合并提取 液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓缩液 0. 5-1. 5L ； 四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，p H= 1. 7时，制备 0? 085mol/L的三氯化铁溶液和0? 05mol/L的硫酸亚铁的混合物；往此混合物中滴加 1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH=9;所获得的四氧化三铁磁粒子立即用水洗 涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得浓度为 0. 0128mol/L ;上述制备的25mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并 超声处理30min ;然后加入10mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h ;所得 溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt %的溶液备用；取50mL的5wt % 的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯 酸甲酯的体积浓度为20%，把此混合液在室温水浴中超声7h ;然后用磁铁收集磁性纳米 粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入 40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50%，室温下超声处理3h ;然后用甲醇 洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循 环四次得到四代树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子；此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用 25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子，即四氧化三铁 磁粒子-PAMAM复合材料； 将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料4-6g加入到第一步制备好的 0. 5-1. 5L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取lh，萃取结束后通过磁分离手段将 吸附萃取黄酮类物质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物 质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料采用有机溶剂乙醇萃取3-5次，合并萃取液，旋转 蒸发得到金花茶中的黄酮类物质； 2) 体外培养的鼻咽癌细胞0呢-1、0呢-2、0呢-22、11呢-2、0666-1、咿29、5-8?和6-108， 上述细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37°C、5%的C02、饱和湿度下传代培养， 实验分组：黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮组中黄酮各剂量 组分别为10、20、30、50和90 ii mol/L ;阳性对照组顺钼用药剂量为0? 25 ii mol/L ;溶剂对照 组加入终浓度为〇. 1 %的DMS0 ;空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞； 3) 检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的作用 a)采用MTT法检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，用流式细胞仪分析细 胞周期，具体步骤包括取对数生长期CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和 6-10B中的一种或两种以上，经质量百分比浓度为0. 25%的胰酶消化，接种于96孔培养板 内，5 X 103个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度 的各种受试物，总体积200 y 1/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96 h，每 孔加入20 ill浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200 ill的DMSO,平板 摇床摇震l〇min，以DMS0调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平 均A值、增殖率PR及抑制率CIR ;增殖率PR=(实验组A值/溶剂对照组A值）X 100% ;抑制 率CIR=(1-试验组平均A值/对照组平均A值）X 100% ;运用曲线回归分析，求出剂量反应 关系方程及回归系数； b) 根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞；取对数生长期的 鼻咽癌细胞，调整密度2. 5 X 104个/mL，置28cm 2培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后加入 不同浓度处理因素，于96h终止培养；取步骤a)中的细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为 0. 25%的胰酶消化，2000r/min离心lOmin，弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS液中，调整细 胞密度至1X106个/ml，2000r/min离心lOmin，弃上清液；快速加入4°C预冷的75%乙醇 lml，使细胞重悬，4°C下保温10_15h ;取单细胞悬液lml，加入10ii g/ml的荧光染料碘化丙 啶10 ill和10mg/ml的RNA抑制剂5 iil，轻微振荡、室温下避光孵育20min，以400目筛网 过滤，取细胞悬液在488nm波长下，用流式细胞仪进行细胞DNA含量检测；经Muticycle AV 软件处理获取数据，对细胞周期各时相分布百分比进行分析，计算细胞周期中G。/^期、S期 和G2/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数PI表示细胞的增殖活性； c) 采用荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内，5 X 103个细 胞/孔，预培养24h，各实验组分别加入10、20、30、50、90 y mol/L的金花茶黄酮类物质活性 提取物，于溶剂对照组、顺钼组分别培养24、48、72和96h，苏木精-伊红染色法染色涂片后 于荧光倒置显微镜下观察； d) 应用免疫组化、Real-time荧光定量RT-PCR、Westem-blot分析癌细胞中蛋白表达变 化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80 y mol/L的黄酮物质作用24h 后，每5-10X 106细胞，加 lmL的Trizol试剂，15-30°C作用15min，弃上清液，向沉淀物中加 0? 5ml 异丙醇 /ml Trizol 试剂，15-3CTC作用 10min，2_8°C，12000 转离心 15min，弃上清液； 再加入lml的75%乙醇/mlTrizol试剂洗涤RNA，2-8°C，7500转离心5min，弃上清液，得到 的样品于_80°C下保存； 使用ABI/9700系统进行各基因 PCR扩增反应，反应程序如下：95°C，10s ;预变性：95°C，5s ;60°C，34s ;40个循环；各种基因的PCR反应均进行扩增产物的熔解曲线分析， 后续采用Western-Blot分析鼻咽癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔 细胞培养板中，培养24h，经80 y mol/L的金花茶黄酮物质作用24h后，PBS液洗涤三次，力口 入冷的细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4°C，14000转离心15min，吸 取上清液，紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致；样品经10-12%聚丙 烯酰氨凝胶电泳4h后，转印到硝酸纤维素膜上，100mA、20-60min ;硝酸纤维素膜经封闭液 封闭3h后，TBS缓冲液洗涤三次，于稀释比例1:500-1:2000的第一抗体工作液中孵育2h ; TBS缓冲液洗涤3次，稀释比1:2000的辣根过氧物酶标记的第二抗体工作液孵育2h，TBS缓 冲液洗涤3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，P-actin蛋白作为内参蛋白； 4) 采用SPSS 12. 0统计软件对结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析； 两两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准a =〇. 05， 5) 检测黄酮物质作用鼻咽癌细胞后的差异表达蛋白，获得双向电泳差异表达图谱， 鉴定差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库匹配，筛选出相关蛋白，所述相关蛋白包括bcl-2， notchl, nm23_Hl, bax 和 E_cadherin〇
2. 根据权利要求1所述的金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其 特征在于，所述RPMI 1640培养基中含10%标准胎牛血清、100 U/ml青霉素和lOOii g/ml 链霉素。
3. 根据权利要求1所述的金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其 特征在于，所述聚丙烯酰氨凝胶电泳中浓缩胶80V、分离胶120V。
4. 根据权利要求1所述的金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其 特征在于，所述封闭液包括5%脱脂乳与0.05% Tween 20, pH7. 6。
【文档编号】C12Q1/68GK104480183SQ201410763950
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】程金生 申请人:嘉应学院医学院