氧化型辅酶i制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种氧化型辅酶I制备方法，所述方法是将核糖先进行溴代，再和烟酰胺进行偶联，得到烟酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大肠杆菌里表达人NRK1和NNMT酶，用镍离子螯合柱纯化得到二个酶；在缓冲体系内，以合成的烟酰胺核糖为底物，加入二种酶和ATP反应，即可制备氧化型辅酶I。本发明是一个低成本的工业化制备氧化型辅酶I的方法。
【专利说明】氧化型辅酶I制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化型辅酶I制备方法。
【背景技术】
[0002]传统的氧化型辅酶I的制备方法，是采用酵母作为原料提取制备。工艺复杂，工业化成本高，价格较高，医药行业尚可以接受。但高昂的成本限制了它在其它工业化应用。特别是近期采用生物还原法制备医药中间体，对辅酶I的需求，非常巨大，采用传统方法制备辅酶，成本较高，市场难以接受，低成本制备氧化型辅酶I的工艺研发非常重要，是拓展辅酶I在其它工业领域使用的瓶颈。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种成本低、适合工业化生产的氧化型辅酶I制备方法。
[0004]本发明的目的是这样实现的:
一种氧化型辅酶I制备方法，所述方法是将保护核糖先进行溴代，再和烟酰胺进行偶联，得到烟酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大肠杆菌里表达人NRKl和NNMT酶，用镍离子螯合柱纯化得到二个酶；在一定缓冲体系内，以合成的烟酰胺核糖为底物，加入二种酶和ATP (三磷酸腺苷)反应，即可制备氧化型辅酶I，是一个低成本的工业化制备氧化型辅酶I的方法。
[0005]所述的缓冲体系为磷酸缓冲液。
[0006]以合成的烟酰胺核糖为底物，加入二种酶和ATP (三磷酸腺苷)，在37°C反应16-24小时，制备氧化型辅酶I。
[0007]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
合成烟酰胺核糖为底物，用酶法合成氧化型辅酶已有大量文献和专利报道，但制备烟酰胺核糖的方法都是采用价格昂贵的三氟甲磺酸三甲基硅酯作为催化试剂，我们采用溴代糖的方法，合成烟酰胺核糖，生产成本制备成本显著下降，非常适合工业化。
[0008]商业化的NRKl和NNMT酶价格昂贵，我们用基因重组的方法获得了人NRKl和NNMT酶cDNA，并实现在大肠杆菌里的高效表达，并用镍离子螯合柱进行纯化，获得低成本高质量的酶，极大地降低了酶的成本。
[0009]本申请建立的用溴代核糖合成烟酰胺核糖和自行用重组的方法制备辅酶I合成相关的酶，实现辅酶I的低成本制备。本申请建立的方法可以实现低成本制备氧化型辅酶I，为氧化型辅酶I在生物还原领域的使用提供必要的保证，是一个低成本的工业化制备氧化型辅酶I的方法。
【具体实施方式】
[0010]实施例1: 将乙酰化的核糖，溶于DMF通入溴化氢，将5位的进行溴代，然后加入烟酰胺，得到保护的溴代核糖，加入烟酰胺，反应24小时，加入氨水去掉核糖上保护基，得到烟酰胺核糖。
[0011 ] 将上述得到的烟酰胺核糖，溶于磷酸缓冲液，加入2倍摩尔量的ATP —定比例和适量的NRKl和NNMT酶，37°C反应16-24小时，用TLC监控氧化型的辅酶I的生成和ATP的减少，直到接近反应完全。反应完的产物用阴离子交换树脂纯化，得到纯度98%的氧化型辅酶
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【权利要求】
1.一种氧化型辅酶I制备方法，其特征在于:所述方法是将核糖先进行溴代，再和烟酰胺进行偶联，得到烟酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大肠杆菌里表达人NRKl和NNMT酶，用镍离子螯合柱纯化得到二个酶；在缓冲体系内，以合成的烟酰胺核糖为底物，加入二种酶和ATP反应，即可制备氧化型辅酶I。
2.根据权利要求1所述的一种氧化型辅酶I制备方法，其特征在于，所述的缓冲体系为磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种氧化型辅酶I制备方法，其特征在于，以合成的烟酰胺核糖为底物，加入二种酶和ATP反应条件为:在37°C反应16-24小时。
【文档编号】C12P19/32GK104480170SQ201410792996
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月20日 优先权日:2014年12月20日
【发明者】郁庆明 申请人:郁庆明