一种驱油微生物的高密度浓缩菌剂发酵和冻干制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种驱油微生物的高密度浓缩菌剂发酵和冻干制备方法，属于微生物驱油高密度浓缩菌剂制备【技术领域】。方法步骤为：a、采用高密度培养技术得到高浓度发酵液；b、发酵液经无菌生理盐水洗涤2～3次离心浓缩；c、加入适量冻干保护剂，混合均匀；d、将菌液均匀分装到冻存管中；e、经真空冷冻干燥机冻干后即可制备成菌剂。本发明可以得到较高浓度的浓缩菌剂，同时制备其冻干粉，操作简单有效，菌种活性高，浓缩菌剂菌浓可以达到109～1010cfu/mL，冻干后菌粉含菌量为1010～1011cfu/g，保藏时间较长，且携带比较方便，减少了驱油现场菌剂的运输成本。
【专利说明】一种驱油微生物的高密度浓缩菌剂发酵和冻干制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物驱油高密度浓缩菌剂制备【技术领域】，具体涉及一种驱油微生物的高密度浓缩菌剂发酵和冻干制备方法。
【背景技术】
[0002]目前国内外用常规采油技术只能采出地下油藏30%?40%的原油，提高石油采收率是目前国内外石油行业研究的关键问题之一。近年以来，利用微生物驱油技术，即利用微生物代谢物表面活性剂、有机酸、微生物调剖、生物气增油、以及界面效应等，取得了一定的效果，石油开采率有所增高。实验室条件下人工培育的微生物驱油效果较好，但是现场条件下，由于工艺流程的不严密性，洁净水源的缺乏，加热保温设备的不足，导致微生物发酵过程中易于染菌、死亡，菌体发酵不能达到需求数量，影响驱油效果。
[0003]目前微生物驱油主要有两种技术，一种方法为采用筛选的驱油微生物培养后注入油藏，另一种方法为利用注入营养物激活本源微生物。油藏是一种特殊环境，其中的矿物组成及性质，孔隙度和渗透率，地层压力，流体的温度、pH、矿化度，原油性质，残余油饱和度等，都会对微生物生长产生明显的影响，同时油藏内本身又含有一些内源微生物，在注入外源微生物或营养后也会发生一些变化，并与外源微生物相互作用。因此无论是外源注入或者内源激活都需要保证目标菌株的高浓度、高活性，保证驱油微生物占据优势。
[0004]现场工厂生产的高活性发酵液是影响驱油效果的一个重要因素，而高活性、高浓度的驱油微生物菌种是限制工厂生产的一项重要指标。目前油田采用的常规技术发酵，由于各种条件限制，只能将菌体的浓度由原来的13?104Cfu/mL提高到16?107cfu/mL，且易于染菌。由于需要发酵液多次循环注入油藏，发酵液通常采用甘油液封的方法进行保藏，由于保藏条件恶劣，难以达到低温、缺氧等条件而降低菌体新陈代谢的条件，导致发酵液中的菌体活性较低，菌体死亡率高，工厂制备发酵液发酵周期较长，菌体染菌率高。实验室条件下，常规甘油保存驱油菌的菌浓只有17?108cfu/mL、菌粉浓度为18?109cfu/g、菌体存活率只有1.4%?9.8%。
[0005]本发明通过高密度培养技术，不仅提高了发酵液浓度，而且提高最终菌体生物量和目标产物的产率，缩小生物反应器体积，降低设备投资，缩短发酵周期，减少水电使用。同时本发明将高浓度的发酵液进行浓缩冻干，不仅操作简单方便，而且菌剂易于携带，降低了现场运输成本。现场工厂生产时可以快速高效的获得高浓度的种子液，减少了发酵周期，同时可以达到抑制其他微生物污染的目的，有利于提高石油采收率。
【发明内容】
[0006]针对现有微生物驱油生产的缺点和不足，本发明提供一种能够长期有效的高浓度、高活性菌剂制备的方法。
[0007]为了达到上述目的，实验方案如下:
[0008]1.将保存于冰箱的斜面菌种接种到固体LB培养基上活化2?3代。
[0009]2.将固体LB平板上的菌落接种到改良的液体培养基中30?37°C、140?160r/min发酵培养20?24h。
[0010]3.将发酵液放入离心管中4000?8000r/min、离心10?15min,弃上清,按比例加入优化的冻干保护剂，充分混合均匀。
[0011 ] 4.将混匀的菌剂放入冻存管或冻干机中。
[0012]5.将混匀的菌剂依次在O?4°C、-20°C?30°C、_60°C?80°C冰箱分别预冻20min?40min、lh?2h、4h?6h,使用冻干机冻干后，即可得到浓缩冻干菌剂。
[0013]所述的琼氏不动杆菌改良的液体培养基组成为:葵花籽油1%?10% (v/v)、糖蜜0.1 %?0.5% (m/v)、氯化钠3?5g、蛋白胨6?10g、酵母膏3?5g,用自来水定容至1L，pH5.0?5.5 ;铜绿假单胞菌改良液体培养基组成为:葵花籽油2%?8% (v/v)、糖蜜0.5%?3% (m/v)、氯化钠3?5g、蛋白胨6?10g、牛肉膏3?8g,用自来水定容至1L,ρΗ7.0 ?8.5。
[0014]所述的琼氏不动杆菌最适冻干保护剂组合为(m/v):脱脂奶粉1%?10%、谷氨酸钠I %?10 %、鹿糖I %?10%;铜绿假单胞菌最适冻干保护剂为(m/v):乳糖10%?15%。121。。灭菌 15min。
[0015]本发明的优点在于:
[0016]本发明通过对不同发酵培养基组成、冻干保护剂组成进行单因素和正交设计优化，得到驱油微生物的最适发酵培养基组成、冻干保护剂组成，利用真空冷冻干燥设备达到菌种保藏的低氧、低水、低温等条件，油田现场试验中，通过菌剂浓缩技术，大大延长了菌种的保藏时间，同时保证了菌种活力的相对稳定性，菌种复壮迅速，活性很快恢复，节约了驱油菌剂发酵时间。高密度浓缩技术使菌种菌浓达到了 1ltl?10ncfu/mL，菌体冻干粉含菌量达到了 111?1012cfu/g，存活率高达74.1%以上。常规甘油保存菌浓为17?18Cfu/mL、菌粉冻干粉含菌量18?109cfu/g，菌体存活率只有1.4%?9.8%。冻干菌剂的制备减少了菌液工业生产的成本，保证了菌剂生物量与活性，同时还可以抑制杂菌污染，提高微生物驱油效果。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]1.配制50mL琼氏不动杆菌改良液体培养基，121°C灭菌15min，接入活化的琼氏不动杆菌菌种，30°C、140r/min摇瓶培养24h。
[0019]2.配制冻存保护剂:脱脂奶粉lg、谷氨酸钠lg、蔗糖lg，用自来水定容到10mL,121°C灭菌15min，备用。
[0020]3.分别取发酵液ImL菌液，用移液器分别吸取发酵液10mL，6000r/min离心lOmin，用无菌生理盐水洗涤后再次相同条件离心，分别加入琼氏不动杆菌优化保护剂lmL，充分混匀，得到菌浓为2.1 X 1010cfu/mL的冻存液。最后每管0.2mL分装到2mL冻存管中，将冻存管依次在4°C、-20°C、_80°C冰箱分别预冻30min、lh、4h后，使用冻干机冻干20h，得到浓缩冻干菌剂，所得菌浓为1.7X 101(lCfu/mL，冻干粉含菌量为2.3 X 101(lCfu/g，冻干菌体存活率为81.0%。
[0021]实施例2
[0022]1.配制1.5L铜绿假单胞菌改良液体培养基，放入3L发酵罐中，121°C灭菌15min，接入活化的铜绿假单胞菌菌种，36°C、160r/min发酵培养24h。
[0023]2.配制冻存保护剂:乳糖15g，用自来水定容到lOOmL，121°C灭菌15min，备用。
[0024]3.分别吸取发酵液lOOmL，7000r/min离心15min，用无菌生理盐水洗涤后再次相同条件离心，分别加入铜绿假单胞菌优化保护剂lmL，充分混合均匀，得到菌浓为1.8X10nCfu/mL的冻存液.最后每管0.2mL分装到2mL冻存管中，将冻存管依次在4°C、-20°C、-80°C冰箱分别预冻30min、2h、4h后，使用冻干机冻干22h，得到浓缩冻干菌剂，所得菌浓为1.4X10ncfu/mL,冻干粉含菌量为3.6X 1012cfu/g，冻干菌体存活率为77.8%。
[0025]实施例3
[0026]1.配制50mL琼氏不动杆菌改良液体培养基，121°C灭菌15min，接入活化的琼氏不动杆菌菌种，37°C、160r/min摇瓶培养24h。
[0027]2.配制冻存保护剂:脱脂奶粉5g、谷氨酸钠10g、蔗糖5g，用自来水定容到10mL,121°C灭菌15min，备用。
[0028]3.分别吸取发酵液10mL,8000r/min离心15min,用无菌生理盐水洗漆后再次相同条件离心，分别加入优化保护剂lmL，充分混合均匀后，得到菌浓为2.1 X 1010cfu/mL的冻存液。最后每管0.2mL分装到2mL冻存管中，将冻存管依次在4°C、-20°C, _80°C冰箱分别预冻30min、lh、4h后，使用冻干机冻干24h，得到浓缩冻干菌剂所得菌浓为1.5 X 1010cfu/mL,冻干粉含菌量为3.4X10ncfu/g，冻干菌体存活率为71.4%。
【权利要求】
1.一种驱油微生物的高密度浓缩菌剂发酵和冻干制备方法，其特征步骤在于将保存于冰箱的驱油微生物斜面菌种接种到固体18平板培养基上活化2?3代山、将固体18平板上的活化后菌落接种到改良的液体培养基中发酵20?2411，得到高密度驱油微生物发酵液将发酵液离心后，弃上清，得到高密度浓缩菌剂，按比例加入优化的冻干保护剂，混合均匀；么将混匀的菌剂均匀分装到冻存管或冻干机中；6、将菌剂依次在0?41、-201?301^-601^ 80条件下分别预冻20111111?40111111、111?211、411?611后，使用冻干机冻干后，即可得到浓缩菌剂冻干粉。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于:驱油微生物为琼氏不动杆菌和铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤6中琼氏不动杆菌改良的液体培养基组成为:葵花籽油1 %?10%(爪八)、氯化钠3?5邑、蛋白胨6?108、酵母膏3?58，用自来水定容至1匕邱5.0?5.5 ；铜绿假单胞菌改良液体培养基组成为:葵花籽油2%?8% 0/^)、糖蜜0.5%?3%化八)、氯化钠3?5邑、蛋白胨6?10邑、牛肉膏3?88，用自来水定容至1匕邱7.0?8.5 ；培养条件为:301?371、140?180x7111111。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤。中离心条件为温度0?81、转速4000 ?80001-/111111^ 10 ?15111111。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤0中高密度浓缩菌剂菌浓为101°?
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤^中琼氏不动杆菌最适冻干保护剂组合为化八):脱脂奶粉1%?10%、谷氨酸钠1%?10%、蔗糖1%?10%；铜绿假单胞菌最适冻干保护剂为(爪八):乳糖10%?15%、121。。灭菌15111111。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤^中的冻干保护剂与浓缩菌剂的比例为1: 1?1: 100。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤6中菌剂干粉含水量为:2%?8%，菌剂干粉含菌量为1011?1012#114，存活率达到71.4%以上。
【文档编号】C12N1/20GK104403982SQ201410802821
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】熊晓辉, 郭汉卿, 陆利霞, 王雪梅, 刘洋 申请人:南京工业大学