一种生物炭固定化微生物共代谢降解三氯乙烯的方法
【专利摘要】本发明一种生物炭固定化微生物共代谢降解三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)的方法，属于固定化微生物处理【技术领域】。生物炭是一种新型材料，呈现紧密层叠的片状结构，表面微孔密集，比表面积较大，吸附性能良好。本发明首次提出以生物炭为载体，利用吸附法固定化荧光假单胞菌，以苯酚为底物共代谢降解土壤中的TCE。比较了两种体系中TCE及苯酚降解的差异，考察了吸附时间、pH、TCE浓度、盐度、加菌量对固定化体系中TCE降解的影响。与游离体系相比，固定化体系对TCE的总体去除率提高了15％，达到55％，且对不良环境的耐受性增强。本发明采用吸附法，以新型材料生物炭为载体，为固定化微生物技术提供了新的方法。
【专利说明】一种生物炭固定化微生物共代谢降解三氯乙烯的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固定化微生物处理【技术领域】，具体涉及利用生物炭固定化荧光假单胞菌，以苯酚作为生长基质，共代谢降解三氯乙烯在污染土壤微生物处理和环境修复中的应用。
技术背景
[0002]固定化微生物技术是用化学或物理的手段，将游离细胞或酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。固定化技术因其特有的细胞密度高、抗毒性强及可反复利用等特点已广泛应用于工业废水处理中，效果较好。据研宄，微生物被固定化后，可以避免微生物分离上的困难以及微生物的流失；还可提高单位空间微生物的密度和生理活性；另外，微生物被固定化后，可以提高其对恶劣环境的抗冲击能力。目前，最常用的微生物固定化方法主要有:包埋法和吸附法，这两种固定化方法有利有弊。包埋法是利用线性网状结构的高分子聚合物载体的加裹作用，将游离细胞截留在形成的高分子材料内，其结构可防止细胞渗出到周围培养基中，但底物仍能渗入与细胞发生反应。包埋法操作简便，微生物本身不参与水不溶性胶网格或微胶囊的形成，活力较高，应用广泛。但包埋材料有一定的传质阻力，会一定程度阻碍底物和氧扩散，并对大分子底物不适用。吸附法又称载体结合法，是通过物理吸附、化学或离子结合，将微生物固定于非水溶性载体。这种方法操作简单，对微生物活力影响小，但所结合的微生物量有限，反应稳定一性和反复使用性差，并且，载体的选择尤为关键。目前应用较为广泛的固定化载体有无机类、多糖与蛋白质类、天然高分子凝胶类和有机合成高分子凝胶类。随着研宄的进行，一些新型固定化载体也不断涌现。
[0003]生物炭是由生物残体(如植物秸杆和动物粪便等)在完全或部分缺氧情况下，经高温慢热(通常低于700°C)产生的一类难熔、稳定、富含碳素、高度芳香化的固态物质。根据制备生物炭的生物质材料来源，生物炭可以分为植物源生物炭和动物源生物炭两大类，其中包括木炭、秸杆炭、谷壳炭，家禽、家畜粪便炭等多种类型。近年来，由于其可以改良土壤，调节温室气体的减排，以及修复受污染场地，以其各方面存在的较强应用潜力，引起了越来越多的关注，成为了一种环境友好的新型材料。生物炭主要由C、H、0等元素组成，以高度富含碳质为主要标志，一般含碳量在70%?80%之间，可以看作是纤维素、羧酸以及其衍生物、吡喃、呋喃及脱水的糖、苯酚、烷烃类及烯烃类的衍生物等成分各异的复杂含碳物质混合构成的统一体，其最主要成分是烷基和芳香结构。观察生物炭的微观构型发现，生物炭是紧密层叠、高度变形的芳香环组成的片状结构，生物炭表面常常分布着密集的微孔，因此比表面积较大，这些性质就使得生物炭具有良好的吸附性能。微生物可以吸附生长于这些微孔中，避免了因为吸附力小而导致固定化菌大量流失的现象，此外这种微孔结构使得载体本身具有较大的比表面积，增强了固定化荧光假单胞菌对土壤中污染物的吸附能力。因此，生物炭从理论上可作为荧光假单胞菌的固定化载体，以苯酚为底物，共代谢降解三氯乙烯。将生物炭作为固定化载体，利用吸附法固定化荧光假单胞菌共代谢降解TCE的研宄尚无报道。
[0004]三氯乙稀(trichloroethylene，TCE)是一种广泛应用的氯代有机溶剂，可用作清洗剂、脱脂剂、萃取剂等；另外，TCE还作为杀虫剂、铁路、汽车、食品加工、纺织、医药和有机化工的原料而广泛应用。随着现代工业的迅速发展，三氯乙烯对环境造成了严重污染，严重影响生态平衡和人类健康。受TCE污染的土壤和地下水的修复技术主要包括物理方法、化学方法和微生物方法，其中物理方法仅将污染物转移到另外一相，没有将污染物清除；化学方法虽可以彻底分解有机物，但易导致生态环境遭到破坏，微生物方法因其具有处理效率高、费用低、降解彻底和适宜现场处理等特点，一直受到广泛关注。在好氧条件下，TCE必须通过共代谢进行降解。其共代谢主要的底物有甲烷、丙烷、戊烷等脂肪族化合物和甲苯、苯酚、苯、甲苯酚等芳香族化合物。本发明选取苯酚为底物，共代谢降解土壤中的TCE。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是从利用固定化微生物降解污染物的理念出发，利用新型碳质材料生物炭作为载体，采用吸附法固定化荧光假单胞菌，以苯酚为基质共代谢降解TCE，达到降低土壤中TCE可提取率及生物有效性的目的，同时提出了将新型环境友好材料生物炭作为载体，应用于以吸附法制备固定化微生物的过程中，增加固定化微生物技术的实用性。
[0006]本发明的生物碳固定化微生物共代谢降解三氯乙稀(trichloroethylene，TCE)的方法，包括以下步骤:
[0007]第一步:荧光假单胞菌的预培养及菌悬液的制备，该方法选取荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet CGMCC1.758)作为TCE共代谢降解菌，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；取适量在含苯酚(100mg/L)的无机盐培养液中驯化过的荧光假单胞菌于营养肉汁培养液中进行扩大培养，培养12h后，离心，用无机盐培养液重悬浮，调节菌悬液OD6tltl,备用；
[0008]第二步:生物炭固定化荧光假单胞菌的制备，采用吸附法，将一定量生物炭粉末(每个降解体系中生物炭含量为体系总质量的1% )与菌悬液0D_= 0.1?0.5混合，搅拌吸附，吸附时间2?20h，使微生物与生物炭充分结合，备用；
[0009]第三步:固定化微生物共代谢降解TCE，取1mL生物炭固定化荧光假单胞菌悬浊液，一定体积的共代谢底物标准储备液、TCE储备液于含2g 土壤的40mL样品瓶中，pH为7?13，1^^浓度0.2?201^/1 ;迅速旋紧瓶盖，摇匀，置于培养箱中，30°C培养若干小时，定点取样测定。
[0010]所述的固定化微生物共代谢降解TCE的方法，第二步生物炭固定化荧光假单胞菌的制备中，菌悬液0D_选取0.2?0.4，与生物炭混合吸附2h，使得后续实验中TCE去除效果最佳；以上述结果为基础，在第三步固定化微生物共代谢降解TCE中，pH选取7、TCE浓度选取I?5mg/L，体系中TCE去除效果最佳。
[0011]本发明选取新型环境友好材料生物炭作为载体，采取吸附法固定化荧光假单胞菌，以苯酚为底物，共代谢降解TCE取得了良好的结果。与游离体系相比，添加生物炭作为载体的固定化体系对TCE的总体去除率提高了 15%，且对不良环境条件(如:pH、盐度、污染物浓度等)的耐受性有一定提高。本发明创造性的将生物炭作为固定化载体，应用于以吸附法制备固定化荧光假单胞菌过程中，共代谢降解TCE，操作简单，可行性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1固定化体系及游离体系中TCE共代谢降解动力学
[0013]图2固定化体系及游离体系中苯酚共代谢降解动力学
[0014]图3吸附时间对TCE共代谢降解的影响
[0015]图4pH对TCE共代谢降解的影响
[0016]图5TCE浓度对TCE共代谢降解的影响
[0017]图6盐度对TCE共代谢降解的影响
[0018]图7加菌量对TCE共代谢降解的影响
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施对本发明进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
[0020]实施例:生物炭固定化荧光假单胞菌共代谢降解TCE的研宄
[0021]选取生物炭作为固定化载体，浓度为100mg/L的苯酚作为共代谢底物，TCE浓度选取2mg/L，选取不同吸附时间、pH、TCE浓度、盐度、加菌量，测定TCE残留率。
[0022]由图1可见，反应72h后基本达到平衡；平衡后游离体系TCE的去除率为39%?41%，固定化体系为55%?58%;与游离体系相比，固定化体系对三氯乙烯的的总体去除率比游离体系提高了 15%。固定化体系中去除的TCE，约有30%被吸附在生物炭上的荧光假单胞菌共代谢降解，另外约有25%被生物炭吸附，由于老化作用吸附在生物炭上的TCE较难被提取。
[0023]由图2可见，对于苯酚而言，不同的反应体系中苯酚在1h内都能完全降解；综合1，2可知，苯酚基本耗尽之后，TCE才开始较快降解。这是由加氧酶的竞争作用引起的，由实验可知苯酚与加氧酶的亲和力远远高于TCE。
[0024]将一定量的生物炭粉末加入菌悬液中，分别搅拌2、6、10、20h，使得生物炭与细菌充分接触、吸附，随后添加到反应体系中，降解92h，间隔一定时间取样测定TCE浓度，结果如图3所示。由图3可见，吸附短时间对TCE的降解影响不大，随着时间的延长(20h)TCE的残留率升高，这可能是由于在没有底物存在的情况下，随着接触时间的增长，细菌的活性降低，从而对TCE的降解作用减弱。
[0025]分别用HCl和NaOH溶液调节无机盐溶液的pH值至7?13，降解92h，间隔一定时间取样测定体系中TCE的浓度，结果如图4所示。由图4可见，在pH为7?10的环境体系中，微生物对TCE的共代谢降解基本未变化；在11?13的环境体系中TCE的共代谢效果随着PH的升高而减弱。这是由于过高的碱性不利于荧光假单胞菌的生长，同时随着pH的变化，生物炭的表面特性也会对细菌的生长产生影响。
[0026]调节TCE浓度分别至0.2、1.0、2.0、10、20mg/L，研宄不同TCE浓度对TCE共代谢降解的影响，实验结果如图5所示。由图可知随着TCE浓度的增大，TCE降解率降低，这主要是由TCE及其降解产物的毒性引起的，然而与游离体系相比固定化体系中TCE对于高浓度TCE及其降解产物的耐受性更强。
[0027]分别向无机盐溶液中加入不同质量的NaCl，使得体系中NaCl的质量浓度分别至0.09%?3% (无机盐培养液的初始盐度0.09% )，反应72h，测定TCE浓度。实验结果如图6所示。由图可见，随着盐度的增大，TCE的去除率变化不大，当盐度为3%时，去除率略有增高；且与游离体系相比较，固定化体系对于盐度的耐受性更强。
[0028]调节菌悬液OD6tltl分别至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，反应72h，测定反应结束后TCE浓度。实验结果如图7所示。由图可知，在一定范围内，随着加菌量的增大，TCE去除率有所提高，当0D_> 0.3后，随着加菌量的增加，TCE去除率不再变化。这可能是由O2、代谢底物等因素引起的。
【权利要求】
1.一种生物炭固定化微生物共代谢降解三氯乙烯的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步:荧光假单胞菌的预培养及菌悬液的制备，该方法选取荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet CGMCC1.758)作为TCE共代谢降解菌，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；取适量在含苯酚(100mg/L)的无机盐培养液中驯化过的荧光假单胞菌于营养肉汁培养液中进行扩大培养，培养12h后，离心，用无机盐培养液重悬浮，调节菌悬液OD6tltl,备用； 第二步:生物炭固定化荧光假单胞菌的制备，采用吸附法，将一定量生物炭粉末(每个降解体系中生物炭含量为体系总质量的1% )与菌悬液0D_= 0.1?0.5混合，搅拌吸附，吸附时间2?20h，使微生物与生物炭充分结合，备用； 第三步:固定化微生物共代谢降解TCE，取1mL生物炭固定化荧光假单胞菌悬浊液，一定体积的共代谢底物标准储备液、TCE储备液于含2g 土壤的40mL样品瓶中，pH为7?13，TCE浓度0.2?20mg/L ;迅速旋紧瓶盖，摇匀，置于培养箱中，30°C培养若干小时，定点取样测定。
2.根据权利要求1所述的固定化微生物共代谢降解TCE的方法，其特征在于，第二步生物炭固定化荧光假单胞菌的制备中，菌悬液0D_选取0.2?0.4，与生物炭混合吸附2h，使得后续实验中TCE去除效果最佳；以上述结果为基础，在第三步固定化微生物共代谢降解TCE中，pH选取7、TCE浓度选取I?5mg/L，体系中TCE去除效果最佳。
【文档编号】C12N11/14GK104450669SQ201410814366
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】孙红文, 李冰, 李岩, 王翠苹 申请人:南开大学