利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羟基丁酸酯的方法
【专利摘要】利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羟基丁酸酯的方法，涉及一种生物合成聚β-羟基丁酸酯的方法。要解决目前混合菌中PHB含量低导致了PHB的提取成本高，合成气中的杂质会导致甲烷氧化细菌迅速失活而无法生长的问题。方法：一、将甲烷氧化混合菌菌液接种到无机盐培养基中培养，期间每隔12小时置换入混合气；二、继续培养，期间每隔24小时置换入空气，培养结束后取一半培养物接入无机盐培养基中继续驯化培养，重复10次，得到可在混合气中生长并富含PHB的甲烷氧化混合菌；三、将筛选得到的甲烷氧化混合菌接种到无机盐培养基中，将空气置换为混合气，培养，中止，进行聚β-羟基丁酸酯含量测定。本发明用于合成聚β-羟基丁酸酯。
【专利说明】利用甲烧氧化混合菌生物合成聚（3-哲基T酸龍的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物合成聚0 -哲基了酸醋的方法。
【背景技术】
[0002] 聚0-哲基了酸醋（P皿）作为能源储备存在于大多数微生物体系中，具有良好的 生物可降解性和生物相容性，用P皿制作各种包装材料可大大减少废弃物对环境的污染， 从根本上解决"白色污染"问题。目前微生物发酵生产是合成P皿的主要手段。但由于发 酵成本较高，使P皿生产难W打开广阔的应用市场。甲烧氧化混合菌是W甲烧氧化细菌为 主体的多种共生菌体的组合，相比纯菌更容易操作，不易受杂菌污染，稳定性高，更有利于 生物合成P皿的连续化工业生产。
[0003] 甲烧氧化混合菌系可W通过微生物间的协同作用，减少底物抑制和杂质毒性，降 低底物的纯度要求，改善甲烧氧化菌的生长和代谢，可进一步实现高密度发酵；混合菌发酵 由于反应器可在非灭菌的开放条件下操作，降低了灭菌能耗和设备成本，可实现连续化生 产，提高生产效率；可使用甲烧化合成气廉价原料，生产成本大幅下降；同时混合菌中的优 势菌甲烧氧化细菌是在普通无机盐培养基中即可生长的寡营养细菌，简单的营养基成分使 得胞内P皿更容易被破壁分离提纯，简化了 P皿提取工艺，降低了提取成本。因此，利用低成 本甲烧化合成气对甲烧氧化混合菌进行开放式高密度培养来获得聚0-哲基了酸醋（P皿） 具有着重要的实用意义。
[0004] 然而，一般情况下，由于混合菌中P皿含量低，增加了 P皿的提取成本。合成气中 的杂质会导致甲烧氧化细菌迅速失活而无法生长。该些已成为限制聚0-哲基了酸醋实际 应用的瓶颈问题。
【发明内容】
[0005] 本发明是要解决目前混合菌中P皿含量低导致了 P皿的提取成本高，合成气中的 杂质会导致甲烧氧化细菌迅速失活而无法生长的问题，提供一种利用甲烧氧化混合菌生物 合成聚0-哲基了酸醋的方法。
[0006] 本发明利用甲烧氧化混合菌生物合成聚0-哲基了酸醋的方法，按W下步骤进 行：
[0007] 一、将甲烧氧化混合菌菌液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，于32°C、180 转/分钟摇床培养5?7天，期间每隔12小时采用抽真空法置换入新鲜的混合气；
[000引二、然后继续培养10?15天，期间每隔24小时采用抽真空法置换入新鲜的空气， 培养结束后取一半培养物按50%的接种量接入新鲜的无机盐培养基中继续驯化培养，重复 本步骤10次，得到可W在混合气中生长并富含P皿的甲烧氧化混合菌；
[0009]=、将步骤二筛选得到的甲烧氧化混合菌W 10%的接钟量接种到无机盐培养基 中，采用抽真空法将空气置换为混合气，于32°C、180转/分钟进行摇床培养，培养5?6天 后中止培养，进行聚0-哲基了酸醋含量测定。
[0010] 步骤一和步骤=中所述混合气是由甲烧化合成气和空气按体积比1 : 1组成的。
[0011] 所述甲烧化合成气是代用天然气；是生物质经过气化生成合成气，经过净化处理， 最后甲烧化合成甲烧含量>90%的代用天然气，合成气中含有焦油、硫化物、氮化物、氨气 一氧化碳、二氧化碳等杂质。
[0012] 本发明公开了一种开放式高密度培养甲烧氧化混合菌生产聚0-哲基了酸醋的 方法。该方法是在采用甲烧化合成气对甲烧氧化混合菌进行定向筛选使混合菌能耐受甲烧 化合成气中的杂质成分并高效积累P皿的甲烧氧化混合菌的基础上，在常规无机盐培养基 中开放式培养。在用本发明的方法对甲烧氧化混合菌进行培养时，开放式培养条件可实现 连续化生产，并降低灭菌成本。与常规培养方法相比，本发明的方法可W极大程度地提高 甲烧氧化混合菌的生长细胞密度，且培养方法简单，细胞中0 -哲基了酸醋含量高，破壁容 易，P皿提取工艺简化，成本降低，其有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将 在0-哲基了酸醋的工业应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0013] 一：本实施方式利用甲烧氧化混合菌生物合成聚0-哲基了酸醋的 方法，按W下步骤进行：
[0014] 利用甲烧氧化混合菌生物合成聚0-哲基了酸醋的方法，按W下步骤进行：
[0015] 一、将甲烧氧化混合菌菌液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，于32°C、180 转/分钟摇床培养5?7天，期间每隔12小时采用抽真空法置换入新鲜的混合气；
[0016] 二、然后继续培养10?15天，期间每隔24小时采用抽真空法置换入新鲜的空气， 培养结束后取一半培养物按50%的接种量接入新鲜的无机盐培养基中继续驯化培养，重复 本步骤10次，得到可W在混合气中生长并富含P皿的甲烧氧化混合菌；
[0017] =、将步骤二筛选得到的甲烧氧化混合菌W 10%的接钟量接种到无机盐培养基 中，采用抽真空法将空气置换为混合气，于32°C、180转/分钟进行摇床培养，培养5?6天 后中止培养，进行聚0-哲基了酸醋含量测定。
[001引 无机盐培养基成分如下（g/L);饥祐1 ;0. 5、馬册04;0. 49、皿2?04.7&0;0. 40、 M拆04 .7&0 ;0. 3、CaCl2 .2&0 ;0. 02、KN03;1. 6、化C1 ;0. 3、FeS04 --&0 ;0. 004、MnS04 .肥0 ; 0. 0004、ZnS04 ? 7&0 ;0. 00034、Na2Mo04 ? 2&0 ;0. 00024、CuS04 ? 7&0 ;0. 00001 ;抑7. 0。
[0019] 用上述方法对甲烧氧化混合菌进行培养时，只需在开放条件下直接将甲烧化合成 气和氧气的混合气通入常规液体无机盐培养基中即可。待发酵液有白色透明粘稠液析出 后，可在细胞中得到聚0-哲基了酸醋。
[0020] 所使用的甲烧氧化混合菌是W甲烧化合成气作为碳源首先对甲烧氧化混合菌进 行定向筛选，使其逐步适应甲烧化合成气中的杂质成分而得到能耐受合成气并高效积累 P皿的甲烧氧化混合菌。在液体培养基中开放培养甲烧氧化混合菌。本实施方式的工艺较 为简单、成本低廉。
【具体实施方式】 [0021] 二；本实施方式与一不同的是；步骤一中甲烧氧化混 合菌菌液的质量百分浓度为30%?50%。其它与一相同。
[0022]
【具体实施方式】本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是；步骤一和步骤= 中所述混合气是由甲烧化合成气和空气按体积比1:1组成的。其它与【具体实施方式】一或 二相同。
[0023] 所述甲烧化合成气是代用天然气；是生物质经过气化生成合成气，经过净化处理， 最后甲烧化合成甲烧含量>90%的代用天然气，合成气中含有焦油、硫化物、氮化物、氨气 一氧化碳、二氧化碳等杂质。
【具体实施方式】 [0024] 四；本实施方式与一至=之一不同的是：于32°C、180 转/分钟摇床培养6天。其它与一至=之一相同。
【具体实施方式】 [0025] 五；本实施方式与一至四之一不同的是：步骤二中继 续培养11?14天。其它与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0026] 六；本实施方式与一至四之一不同的是：步骤二中继 续培养12?13天。其它与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0027] 走；本实施方式与一至六之一不同的是：步骤=中培 养5. 5天后中止培养。其它与一至六之一相同。
[002引为验证本发明的有益效果，进行W下实验：
[0029] 实施例1、甲烧氧化混合菌的定向筛选；
[0030] 甲烧氧化混合菌皿6T是在黑龙江省大庆油田富含沼气地区的±壤中采用菌 体的常规方法筛选得到。对甲烧氧化混合菌皿6T进行群落多样性鉴定，甲烧氧化混合 菌皿6T中至少包括下面的菌属：甲基弯菌（Methylosinus trichosporium)、甲基胞囊菌 (Methylocystis strains)、Methylophilus methylotrophus。
[0031] W黑龙江省大庆油田富含沼气地区的上壤中培养筛选获得的甲烧氧化混合菌 皿6T为例，具体过程如下；
[003引定向筛选在一个500血S角瓶中进行，将100血无机盐培养基添加到S角瓶中，将 甲烧氧化混合菌皿6T菌液接种到lOOmL无机盐培养基中，接种量为10 %。接种后每隔12小 时采用抽真空法置换入新鲜的混合气，于32摄氏度，180转/分钟摇床培养6天后，每隔24 小时采用抽真空法置换入新鲜的空气，继续培养12天后，取一半培养物接入新鲜的lOOmL 无机盐培养基中继续驯化培养，反复操作10次。经过定向筛选后最终得到可W在混合气 中生长并富含P皿的甲烧氧化混合菌。甲烧氧化混合菌皿6T菌液质量百分浓度是30%? 50%。
[0033] 实施例2、本发明的甲烧氧化混合菌培养方法与甲烧氧化细菌常规培养方法的比 较
[0034] 对定向筛选后的甲烧氧化混合菌进行本发明培养方法与甲烧氧化菌常规培养方 法的培养效果比较，具体过程如下：
[0035] 1、甲烧氧化细菌Meth}dosinus trichosporium IMV 3011和甲烧氧化混合菌群 皿6T的常规培养，具体方法为：
[0036] 将甲烧氧化细菌Meth}dosinus trichosporium IMV 3011和实施例1筛选得到的 甲烧氧化混合菌群皿6T分别W 10%接钟量接种在含有100毫升无菌无机盐培养基的500 毫升密闭的=角瓶中，采用抽真空法将空气置换为甲烧和氧气按体积比1 : 10组成的混合 气，32°C，180转/分钟进行摇床培养，每隔24小时取样，采用光密度法，在SP-756P型分光 光度计上测定波长600纳米处的光密度值，并采用抽真空法置换入新鲜的甲烧和氧气按体 积比1 : 10组成的混合气，在相同条件下继续培养，培养5天后中止培养。
[0037] 所述甲烧氧化细菌Meth}dosinus trichosporium IMV 3011购买自兰州化学物理 研究所。
[003引聚0 -哲基了酸醋定量测定；将适量的表面活性剂（甜菜碱），馨合物巧DTA二钢 盐）和细胞溶解于50mL去离子水中，用5mol/L的化0H调节抑值，在抑=13的条件下， 于50°C W 1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min，将离屯、得到的沉淀物质用去离子水和 丙酬各洗漆一次，于70°C恒温干燥箱内烘干称重。
[0039] 2、甲烧化合成气对甲烧氧化细菌Meth}dosinus trichosporium IMV 3011和甲烧 氧化混合菌群皿6T进行培养
[0040] 将甲烧氧化细菌Meth}dosinus trichosporium IMV 3011和甲烧氧化混合菌皿6T W 10%接钟量接种在含有lOOmL无机盐培养基的500mLS角瓶中，采用抽真空法将空气置 换为甲烧化合成气和空气按体积比1 : 1组成的混合气，32°C，180转/分钟进行摇床培养， 每隔24小时取样进行细胞密度测定，培养5天后中止培养，进行聚0 -哲基了酸醋含量测 定。
[0041] 经定向筛选的甲烧氧化混合菌皿6T在甲烧化合成气中培养的聚0 -哲基了酸醋 的产量高于W甲烧单独培养的产量，主要原因是合成气中的氨气和一氧化碳对P皿的积累 有促进作用。用本方法培养5天细胞中聚0-哲基了酸醋含量为0.95克/升。结果如表 1所示：
[0042] 表 1
[0043]
【权利要求】
1. 利用甲烷氧化混合菌生物合成聚e-羟基丁酸酯的方法，其特征在于该方法按以下 步骤进行： 一、 将甲烷氧化混合菌菌液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，于32°c、180转/ 分钟摇床培养5?7天，期间每隔12小时采用抽真空法置换入新鲜的混合气； 二、 然后继续培养10?15天，期间每隔24小时采用抽真空法置换入新鲜的空气，培养 结束后取一半培养物按50%的接种量接入新鲜的无机盐培养基中继续驯化培养，重复本步 骤10次，得到可以在混合气中生长并富含PHB的甲烷氧化混合菌； 三、 将步骤二筛选得到的甲烷氧化混合菌以10 %的接钟量接种到无机盐培养基中，采 用抽真空法将空气置换为混合气，于32°C、180转/分钟进行摇床培养，培养5?6天后中 止培养，进行聚羟基丁酸酯含量测定。
2. 根据权利要求1所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 _羟基丁酸酯的方法，其 特征在于步骤一中甲烷氧化混合菌菌液的质量百分浓度为30%?50%。
3. 根据权利要求1或2所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 -羟基丁酸酯的方 法，其特征在于步骤一和步骤三中所述混合气是由甲烷化合成气和空气按体积比1 : 1组 成的。
4. 根据权利要求3所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 -羟基丁酸酯的方法，其 特征在于于32°C、180转/分钟摇床培养6天。
5. 根据权利要求4所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 -羟基丁酸酯的方法，其 特征在于步骤二中继续培养11?14天。
6. 根据权利要求4所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 -羟基丁酸酯的方法，其 特征在于步骤二中继续培养12?13天。
7. 根据权利要求5所述的利用甲烷氧化混合菌生物合成聚0 -羟基丁酸酯的方法，其 特征在于步骤三中培养5. 5天后中止培养。
【文档编号】C12P39/00GK104513847SQ201410819674
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】董静, 辛嘉英 申请人:哈尔滨商业大学