生物反应芯片及其在pcr反应中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物反应芯片及其在PCR反应中的应用。所涉及的生物反应芯片包括主体板，所述主体板上开设有多级反应槽，每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。将多级反应槽按可容纳生物反应试剂的量从大到小排序，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。本发明提供的生物反应芯片在进行PCR反应定量检测时无需定量标准品，可以进行溶液核酸浓度的定量检测，实现对核酸分子进行绝对定量检测。
【专利说明】生物反应巧片及其在PCR反应中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生化领域试验用仪器，具体设及一种生物反应巧片及其在PCR反应中 的应用。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（PCR)是一种简单、高效、特异性强的分子生物学检测方法。经 过30多年的发展已经衍生出了多种多样的扩增流程，如实时巧光定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)、环介导等温扩增技术（LAMP)、指数后线性扩增PCR技术（LATE-PCR)等。该些技 术的产生和发展，使得PCR技术逐步成为分子生物学应用最为广泛的技术之一，特别是在 病原微生物鉴定方面，实现了快速而又高特异性鉴别。因此，在各卫生防疫部口、检验检疫 中屯、实验室广泛配置了 PCR定量装置。然而，类似实时巧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR) 的定量体系，必须使用标准品，进行的是相对于标准品浓度的相对定量，而且由于检测精密 度要求高，巧光定量检测系统设备昂贵、环境要求高。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一是提供一种生物反应巧片。
[0004] 为此，本发明提供的生物反应巧片包括主体板，所述主体板上开设有多级反应槽， 每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。
[0005] 进一步，将多级反应槽按可容纳生物反应试剂的量从大到小排序，相邻级的反应 槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。
[0006] 优选的，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比大于等于5。
[0007] 更优选的，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为5-20。
[000引更进一步，每级反应槽包括若干个单体反应槽，且每级反应槽包括的单体反应槽 个数相同或不同，同一级反应槽中的若干个单体反应槽之间相互独立且彼此可容纳的生物 反应试剂的量相同。
[0009] 可选的，每级反应槽中单体反应槽的个数为5-20。一般相邻级的反应槽体积量比 越小每级反应槽个数取值越大。
[0010] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之二是提供上述生物反应巧片在PCR 反应中的应用。
[0011] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之S是提供上述生物反应巧片在PCR 反应绝对定量检测中的应用。
[001引为此，本发明提供的生物反应巧片在PCR反应定量检测中的应用包括：
[0013] 将待测样品和PCR反应试剂装载在上述生物反应巧片中进行PCR扩增反应后，读 取数据和计算待测样品中被测物质的含量；
[0014] 所述读取数据为读取每级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数，其中第i级反应 槽中呈阳性的单体反应槽的个数为a;，i = 1，2, 3,…，I ;1 > 2, 1 ;
[0015] 利用（式1)计算待测样品中被测物质的含量c: 口 / 巧
[0016] 之W =以=1 n,' . Uj (式 1)
[0017] 其中；
[001引 Vi为第i级反应槽的单体反应槽的体积，V i取值范围；1化-lOOuL ;
[0019] 叫为第i级反应槽的单体反应槽的个数，n 2。
[0020] 所述的待测样品为病原微生物核酸。
[0021] 待测样品中被测物质含量的校准值(；。。1为：
[00巧 Creal= C ? Rs，其中Rs为PCR反应的最小检出限。
[0023] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0024] 1、本发明提供的生物反应巧片无需定量标准品，可W进行溶液核酸浓度的定量检 测。
[0025] 2、利用本发明的生物反应巧片进行定量检测时，定量检测的浓度由检测数值直接 获得，因此为溶液核酸的绝对浓度。与现有技术依赖定量标准品所获得的相对溶液浓度值 相比，具有更高的可靠性。
[0026] 3、本发明提供的生物反应巧片，与现有PCR定量检测技术相比具有装置小、便携 性强、检测速度快的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1提供的生物反应巧片的结构示意图（单位：毫米）；
[002引图2为实施例2的方法流程示意图；
[0029] 图3为对比例的结果对比分析图；该图中的CHIP表示本发明巧片的校正前结果 C，CHIP C0R表示本发明巧片的校正后结果Cud，两者相差Rs倍。
【具体实施方式】
[0030] 本发明的主体板的材质为可W用于生物反应的材质，例如 PDMS(?olydimet的Isiloxane)。可选的，PDMS材质的巧片制成后，采用臭氧等离子进行表 面处理，使之表面具有亲水性，有利于样本和PCR反应液进入反应孔。
[0031] 可选的，本发明的主体板为圆形板、S角形板、方形板或楠圆形板W及中屯、对称的 板型。
[0032] 可选的，本发明的单体反应槽为圆形反应槽或方形反应槽。
[0033] 进一步可选的，本发明的主体板为圆形板，所述单体反应槽为圆形反应槽。
[0034] 本发明的主体板上开设有至少两级反应槽。
[0035] 本发明提供的上述生物反应巧片在PCR反应中的应用包括；
[0036] 将生物反应试剂装载于生物反应巧片的各级反应槽中，且各级反应槽的装载量为 饱和状态（装满）；
[0037] 在设有反应槽的主体板面上加盖反应盖；
[003引将装载有生物反应试剂和加盖有反应盖的巧片置于合适的温度下进行PCR扩增 反应。
[0039] 可选的，将生物反应巧片置于离屯、锻膜机上，将足够量生物反应试剂置于主体板 上，通过离屯、锻膜机的离屯、作用将生物反应试剂装载于各级反应槽中。可选的，所述主体板 的底面贴有封闭薄膜。可选的，所述反应盖为表面涂覆有PDMS的载玻片。可选的，所述封 闭薄膜为PC防水材料。
[0040] 本发明的生物反应巧片适用于其他任何PCR衍生流程，包括巧光PCR、环介导等温 扩增技术（LAMP)、指数后线性扩增PCR技术（LATE-PCR)等。
[0041] 本发明所述的最小检出限Rs取决于扩增方法（PCR衍生流程）有关系，氏的取值 范围一般是是大于等于1小于等于10。具体如使用环介导等温扩增技术（LAMP) Rs为1到 5,指数后线性扩增PCR技术（LATE-PCR)Rs为5左右，巧光PCR技术Rs为10左右。例如； 采用已定量的己肝核酸标准品（lOOOcopies/mL)梯度稀释，使用拟采用的扩增方法（LAMP) 和试剂体系进行等体积批量扩增（lOuL)(浓度较小、稀释可能有误差，每一种浓度都扩增2 个8连管，共16管），取观察能够到的最小浓度为Rs。
[0042] 本发明（式1)推导过程如下；
[0043] 设生物反应巧片中由内到外分为多级反应槽（反应槽的级数大于等于2, 一般其 取值越大，精度越大），每级有若干个反应体积相同的单体反应槽，巧片上所有单体反应槽 体积之和为V。
[0044] 在检测灵敏度Rs范围内，溶液体积V(V表示所有孔中溶液的总体积）中只有一个 核酸分子，且不在一个孔内（第i级第j孔）的概率为：
[0045] Psi = 1 -脊;i二1，2,…，ffl: j二1，2，…，n: V。表示第i级第j孔的体积。
[0046] 假设有k个核酸分子在V体积的溶液内，因此，样品溶液的绝对浓度为： /c
[0047] C 二一
[0048] 一个孔内（第i级第j孔）不含有任何核酸分子的概率为：
[0049]
【权利要求】
1. 一种生物反应芯片，包括主体板，其特征在于，所述主体板上开设有多级反应槽，每 级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。
2. 如权利要求1所述的生物反应芯片，其特征在于，将多级反应槽按可容纳生物反应 试剂的量从大到小排序，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。
3. 如权利要求1所述的生物反应芯片，其特征在于，相邻级的反应槽可容纳生物反应 试剂的体积量比大于等于5。
4. 如权利要求1所述的生物反应芯片，其特征在于，相邻级的反应槽可容纳生物反应 试剂的体积量比为5-20。
5. 如权利要求1所述的生物反应芯片，其特征在于，每级反应槽包括若干个单体反应 槽，且每级反应槽包括的单体反应槽个数相同或不同，同一级反应槽的若干个单体反应槽 之间相互独立且彼此可容纳的生物反应试剂的量相同。
6. 如权利要求1所述的生物反应芯片，其特征在于，每级反应槽中单体反应槽的个数 为 5-20。
7. 权利要求1-6中任一权利要求所述生物反应芯片在PCR反应中的应用。
8. 权利要求1-6中任一权利要求所述生物反应芯片在PCR反应绝对定量检测中的应 用，包括： 将待测样品和PCR反应试剂装载于权利要求1-6中任一权利要求所述的生物反应芯片 中进行PCR扩增反应后，读取数据和计算待测样品中被测物质的含量； 所述读取数据为读取每级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数，其中第i级反应槽中 呈阳性的单体反应槽的个数为i = 1，2, 3,…，I ;1彡2, ai> 1 ; 刹用（式I) i+筧待测样品中被测物质的含量C :
其中： Vi为第i级反应槽的单体反应槽的体积，V i取值范围：InL-IOOuL ; Iii为第i级反应槽的单体反应槽的个数，n 2。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，待测样品中被测物质含量的校准值C Mal为： CMal= C · Rs，其中RsSPCR反应的最小检出限。
【文档编号】C12Q1/68GK104513786SQ201410828349
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】闫永平, 高洁, 王波, 肖丹, 张磊, 王安辉 申请人:中国人民解放军第四军医大学