一种耐多种纯有机溶剂的脂肪酶及其编码基因和在多种高产酯类化合物合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种耐多种纯有机溶剂的脂肪酶及其编码基因和在多种高产酯类化合物合成中的应用。本发明的脂肪酶SSL1970，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述的脂肪酶SSL1970的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的脂肪酶SSL1970来源于链霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46，能在多种纯有机溶剂中长时间保持其结构和生物活性的完整，特别是能耐受多种醇，并以各种醇为反应介质催化这些醇作为底物之一与多种不同链长的脂肪酸反应，用于多种高产酯类化合物的生物制造。
【专利说明】一种耐多种纯有机溶剂的脂肪酶及其编码基因和在多种高 产酯类化合物合成中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程和生物催化【技术领域】，具体涉及一种耐多种纯有机溶剂的脂 肪酶及其编码基因和在多种高产酯类化合物合成中的应用。
【背景技术】：
[0002] 中短链脂肪酸酯是一类非常重要的香料化合物，主要用于配制奶油及草莓、樱桃 等所有水果型香精，也可用于香烟、日化产品或其它产品的香原料，同时也是一种优良的有 机溶剂。长链脂肪酸酯具有很好的润滑性，主要用作乳剂类化妆品的润滑剂，能赋予化妆品 良好的涂敷性，与皮肤有较好的亲和性，易被皮肤组织所吸收，使皮肤柔软。工业上生产这 类化合物的方法主要是使脂肪酸和醇直接酯化，一直沿用强酸（如浓硫酸、对甲苯磺酸等） 作催化剂。尽管强酸作为酯化合成催化剂具有理想的催化活性且价格低廉，但强酸易使有 机物碳化和氧化，且具有选择性差、产品色泽深、能耗高、副反应多、对设备腐蚀严重和污染 环境等缺点。再有，传统的生物提取法又由于受资源匮乏、产率低、分离困难等缺点的制约 而无法实现规模化生产。因此，国内外都在探索一些种绿色环保并且高效的生产方法，其中 生物催化（酶）法是人们最为关注的生产方法之一。酶在工业生产中具有很大的优势，能 在常温常压下反应，反应速率快，催化作用专一，无污染，价格较低等。
[0003] 脂肪酶（EC3. I. 1. 3)是一种酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水 解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸；而它在非水介质中又能催化酸的羧基与 醇的羟基进行脱水缩合反应产生酯类化合物。脂肪酶广泛的存在于动物、植物和微生物中， 其中动物胰脏和微生物是脂肪酶的主要来源。目前脂肪酶已经被广泛的应用于食品酿造、 农业、医药化学、制浆造纸工业、污水处理和生物修复等领域。其中，有些脂肪酶能在有机介 质中起催化作用，被广泛应用于酯类化合物的合成。目前，在有机介质中脂肪酶催化相应的 酸和醇合成辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯和戊酸乙酯已有相关的报道。在食品加工方面， 固定化的脂肪酶现在已被用于芳香酯的合成，比如利用脂肪酶制备的呈天然水果味的低分 子量芳香酯。
[0004] 目前有关辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯等酯类化合物的酶法合成均是以相应的 酸和醇为底物在正己烷、正庚烷、异辛烷等有机介质中进行，最终的酯化率一般为90%左 右，底物酸的浓度在〇. 04?I. OM之间。由于大部分脂肪酶对高浓度的酸或者醇极为敏感， 故在合成反应中底物浓度往往较低进而获得产物的含量较少，无法满足工业化的需求。因 此寻找天然耐高浓度的酸或者醇的脂肪酶，使其在酯类化合物的合成中提高催化效率以及 产物的含量具有重要的实用意义。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一个目的是提供一种耐多种纯有机溶剂的脂肪酶SSL1970。该脂肪 酶SSL1970来源于链霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46,能在多种纯有机溶剂 中长时间保持其结构和生物活性的完整，特别是能耐受多种醇，并以各种醇为反应介质催 化这些醇作为底物之一与多种不同链长的脂肪酸反应，用于多种高产酯类化合物的生物制 造。
[0006] 本发明的脂肪酶SSL1970,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种编码脂肪酶SSL1970的基因，其特征在于，编码 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的脂肪酶SSL1970的基因。
[0008] 本发明的编码脂肪酶SSL1970的基因，优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明的第三个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码脂肪酶 SSL1970的基因。
[0010] 本发明的第四个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。
[0011] 本发明的第五个目的是提供脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟 基进行脱水缩合反应产生酯类化合物中的应用。
[0012] 当本发明的脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟基进行脱水缩合 反应产生酯类化合物时，所有反应不需要加入额外的反应介质而是直接以其中一种底物 (醇）作为反应的介质进行高效的催化合成。
[0013] 所述的酯类化合物，优选为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、 十一酸分别与乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇合成相 应的中短链脂肪酸酯化合物，或月桂酸、十四酸、软脂酸分别与丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己 醇合成相应的长链脂肪酸酯化合物。
[0014] 所述的脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟基进行脱水缩合反应 产生酯类化合物中的应用，底物酸的浓度为1?4M，最适为2?3M ;催化反应的温度为40? 50°C ;脂肪酶SSL1970在催化反应体系中的用量为10g/L。
[0015] 在本发明的催化合成反应体系中，所述的各种醇分别作为反应的介质，同时作为 其中的底物之一提供羟基，所述的各种底物酸的浓度为I. 0M，合成反应温度为40°C，脂肪 酶SSL1970的使用量为10g/L的条件下，合成相应的芳香酯类香料，反应20h后酯化率全部 达到100%。
[0016] 本发明的脂肪酶SSL1970,水解活性最高的底物为对硝基苯基辛酸酯（p-NP C8)， 其次为对硝基苯基月桂酸酯（P-NP C12)与对硝基苯基己酸酯（p-NP C6)。反应的最适pH 值为8. 5,在pH = 7. 5?10. 0之间具有较高的水解活性。反应的最适温度为40°C，30? 45°C之间保留有较高的水解活性。
[0017] 本发明的脂肪酶SSL1970经冷冻干燥制成酶粉后，对多种纯有机溶剂具有很好的 耐受性，特别是对多种醇具有很好的耐受性，使得在不需要添加额外的反应介质的条件下 可应用于各种脂肪酸酯化合物的合成。合成反应中，底物酸的最高浓度达到4. OM以上；合 成反应的最适温度为50°C;合成反应中催化剂脂肪酶SSL1970的使用量为10g/L ;各种酯类 化合物获得的最高酯化率为100%，最高初始酯化速率达到50mmol
[0018] 本发明与传统的化学合成相比，具有反应条件温和、生产能耗低、产品质量好和无 污染的优点；与目前报道的酶法合成相比，不需要添加额外的反应介质，产物含量高，分离 步骤更简捷。该酶用于各种酯类化合物香料以及生物表面活性剂的合成，制备的化合物纯 度高、品质好、分离步骤简捷等，属于天然产物，可应用于食品、香烟和日化产品等生产行 业，因此具有广泛的应用前景。
[0019] 本发明从来源于链霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46中克隆到一个 新的脂肪酶SSL1970,该脂肪酶的一大特点是，能耐受多种纯有机溶剂，特别是多种醇，在这 些有机溶剂中能长时间保持酶整体结构和生物活性的完整；另一新颖的特点是，能够催化 多种醇（从乙醇到癸醇，以及比癸醇分子量更大的醇）作为反应介质的同时也作为底物之 一与多种羧酸（从丁酸到十一酸）进行反应，高效合成一系列相应的中短链脂肪酸酯类化 合物，并且酯化率最高均能达到100%，初始酯化速率在较高浓度的底物酸存在下表现较高 数值，以及催化丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇分别与月桂酸、十四酸、软脂酸反应生成相应 的长链脂肪酸酯类化合物，酯化率大于95%。
[0020] 用于本发明的链霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46为本发明人所在 的实验室从南海深海沉积物中分离得到并保藏。本 申请人:保证自申请日起20年内向公众 提供该链霉菌 Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46〇
【专利附图】
【附图说明】：
[0021] 图1是脂肪酶对不同底物p-NP (C2-C16)进行水解分析的图；
[0022] 图2是以p-NP C8为底物，在不同pH的缓冲液下分析脂肪酶SSL1970水解活性的 影响图；
[0023] 图3是以p-NP C8为底物，在pH = 8. 5的Tris-HCl缓冲液下分析不同反应温度 对脂肪酶SSL1970水解活性的影响图；
[0024] 图4是在各种纯的有机溶剂处理下脂肪酶SSL1970的耐受性；
[0025] 图5是脂肪酶SSL1970催化各种酸和醇生成中短链脂肪酸酯的反应模式；
[0026] 图6是脂肪酶SSL1970催化各种酸和醇生成长链脂肪酸酯的反应模式；
[0027] 图7是脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸生成戊酸戊酯的底物酸浓度影响初始酯化 速率的分析图；
[0028] 图8是脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸生成戊酸戊酯的底物酸浓度影响酯化率的 分析图；
[0029] 图9是脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸生成戊酸戊酯的反应温度影响初始酯化速 率的分析图；
[0030] 图10是脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸生成戊酸戊酯的反应温度影响酯化率的 分析图。
【具体实施方式】：
[0031] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0032] 在本发明实施例中所用到的限制性内切酶EcoRI和Hind III购自ThermoFisher公 司；表达质粒pET-28a(+)购自Novagen公司；大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞购自 北京全式金生物技术有限公司。
[0033] 实施例1 :
[0034] 1、链霉菌 Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46 的分离与鉴定
[0035] 链霉菌Streptomyces scopuliridis分离自南海深海沉积物，培养好的菌体用 于总 DNA 的提取。所用试剂盒为 GeneJET Genomic DNA Purification Kit (购自 Thermo scientific 公司）。
[0036] 2、脂肪酶SSL1970基因的克隆、表达及酶粉制备
[0037] 根据全基因组中脂肪酶SSL1970的基因序列分析，设计相应引物扩增该基因并连 接到表达载体pET-28a(+)上，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行高效表达。
[0038] 设计引物如下：上游引物为V -CGGAATTCGTCCGGGCCACAGGGCTGAC-3，；下游引 物为 Y -ACCCAAGCTTTCAGCCGAGCACCGACGAGC-3,，上下游引物的 Y 端分别设计了 EcoRI 和Hind III酶切位点（下划线标记部分），以链霉菌Streptomyces scopuliridis的基因组 DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：弘乃训设抓1' FastPfu Buffer 10 yL，dN 丁？8(6&(*2.51111)5 4 1^，上游引物（1(^]\〇14 1^，下游引物（1(^]\〇14 1^，模板0嫩（10〇1^/ μ L) 1 μ L, TransStart" FastPfu DNA PolyMerase (2. 5U/ μ L) 1 μ L，ddH20 31 μ L。PCR 扩增 反应程序为：95°C保温2分钟，然后95°C 20秒、60°C 20秒、72°C 30秒进行30个循环，最后 72°C进行5分钟。对PCR产物进行测序，上述引物扩增得到的PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其含有951bp的碱基，命名为SSL1970基因，将其在ncbi中进行blastx比对 分析，表明其与来源 Streptomyces scopuliridis 的脂肪酶（ACCESSION :WP_030354947)具 有96%的一致性，同时也与其它的Streptomyces属来源的脂肪酶具有较高的序列一致性， 但均小于87%。根据这株菌中的DNA序列，以及生物信息学知识推测这个orf编码一个脂 肪酶，但是并没有对这个脂肪酶的功能进行相应鉴定以及应用的相关报道。脂肪酶SSL1970 基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，含有316个氨基酸，命名为脂肪酶SSL1970。
[0039] 对上述含有脂肪酶SSL1970基因的PCR产物用胶回收试剂盒（购自Magen公司） 纯化回收目的扩增片段，分别用EcoRI和Hind III酶切含有脂肪酶SSL1970基因的PCR产物 (目的扩增片段）和表达质粒pET-28a(+)，然后将酶切产物进行连接，使脂肪酶SSL1970基 因插入到表达质粒pET-28a (+)中，经测序验证，确认脂肪酶SSL1970基因插入到表达质粒 pET-28a(+)的EcoRI和Hind III位点之间，由此得到重组表达质粒pET-28a(+)-SSL1970。
[0040] 把重组表达质粒pET-28a(+)-SSL1970转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的感受态 细胞中，挑取转化子于LB液体培养基中，在37°C摇床中培养，当OD6c?达到0. 8左右时，加入 IPTG使其终浓度达到0. 2mmol/L，转置20°C继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好 的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在 冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，ll〇〇〇rpm/min离心20分钟离心收集上 清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于纯酶与酶粉的制备。粗酶液通过镍离子亲和层析柱 纯化后得到纯酶（由脂肪酶SSL1970基因编码的脂肪酶SSL1970,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）。酶粉直接用粗酶液冻结后，在冷冻干燥机中制备。
[0041] 3、脂肪酶SSL1970的水解活性分析
[0042] 标准反应体系为lmL，包含0. 05 μ g纯酶（脂肪酶SSL1970)，IOOmM的p-NP酯底 物，IOOmM的pH = 8. 0的磷酸盐缓冲液，30°C反应10分钟，然后利用酶标仪在405nm处检测 底物的水解情况，并以相对酶活性进行表征。
[0043] (1)、底物特异性分析
[0044] 按照标准反应体系，对不同底物p-NP (C2-C16)进行水解分析，结果如图1所示。
[0045] 脂肪酶SSL1970水解活性最高的底物为对硝基苯基辛酸酯（p-NP C8)，其次为对 硝基苯基月桂酸酯（p-NP C12)与对硝基苯基己酸酯（p-NP C6)。
[0046] (2)、最适反应pH值的分析
[0047] 按照标准反应体系，以p-NP C8为底物，在不同pH的缓冲液下分析脂肪酶SSL1970 的水解活性，结果如图2所示。
[0048] 脂肪酶SSL1970的最适pH值为8. 5,在pH = 7. 5?10. 0之间具有较高的水解活 性。
[0049] (3)、最适反应温度的分析
[0050] 按照标准反应体系，以p-NP C8为底物，在pH = 8. 5的Tris-HCl缓冲液下分析不 同反应温度对脂肪酶SSL1970水解活性的影响，结果如图3所示。
[0051] 脂肪酶SSL1970的最适温度为40°C，30?45°C之间保留有较高的水解活性。
[0052] 4、脂肪酶SSL1970对纯有机溶剂耐受性的分析
[0053] 等量的酶粉在室温条件下（25°C )用各种纯的有机溶剂（乙醇、丙醇、丁醇等）溶 解处理24h，然后离心除去有机溶剂并抽干后用适量的缓冲液溶解。以不加任何有机溶剂处 理的组份作为对照并设定为100%酶活，在最适PH值、最适反应温度等条件下测定经各种 有机溶剂处理后脂肪酶SSL1970的相对酶活，结果如图4所示。
[0054] 5、脂肪酶SSL1970催化羧酸与醇合成酯类化合物
[0055] 标准反应体系为10ml，以相应的醇（乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、 己醇、庚醇、辛醇、壬醇或癸醇）作为反应的介质以及底物之一，添加浓度为I. OM的羧酸 (乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸或十一酸）混匀，加入l〇g/L脂肪酶 SSL1970,在200rpm/min的摇床中进行反应，中短链脂肪酸酯合成的反应样式如图5所示。 产物通过GC/MS进行结构鉴定，酯化率通过酸碱滴定法以及GC测定底物酸的消耗量间接计 算得出，反应20h后酯化率均可达到100%。
[0056] 标准反应体系为10ml，以相应的醇（丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇或己醇）作为反应的 介质以及底物之一，添加浓度为I. OM的羧酸（月桂酸、十四酸或软脂酸）混匀，加入10g/L 脂肪酶SSL1970,在200rpm/min的摇床中进行反应，长链脂肪酸酯合成的反应样式如图6所 示。产物通过GC/MS进行结构鉴定，酯化率通过酸碱滴定法以及GC测定底物酸的消耗量间 接计算得出，酯化率大于95%。
[0057] 6、各种反应参数对初始反应速度和酯化率的影响
[0058] 在标准反应条件下，以脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸合成戊酸戊酯作为展示的 例子试验了不同底物酸浓度以及不同合成温度对初始酯化速率与酯化率的影响。
[0059] (1)、底物酸的浓度对初始酯化速率的分析
[0060] 按照标准反应体系，以脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸的反应为例，分析不同酸 浓度对初始酯化速率的影响，结果如图7所示。当底物戊酸的浓度为3. OM时，初始酯化速 率等于20mmol 而当底物戊酸的浓度达到4. OM时，由于受高浓度底物酸的抑制作 用，初始酯化速率有所下降，但酯化率仍然能达到98 %以上。
[0061] ⑵、底物酸的浓度对酯化率的分析
[0062] 按照标准反应体系，以脂肪酶SSL1970催化戊醇与戊酸的反应为例，分析不同酸 浓度对酯化率的影响，结果所示如图8。当底物戊酸的浓度不大于3. OM时，酯化率能达到 100%;而当底物戊酸的浓度大于3. OM时，由于反应过程产生大量水分子使得最终酯化率有 所下降，为98%。
[0063] (3)、反应温度对初始酯化速率的分析
[0064] 按照标准反应体系，以脂肪酶SSL1970催化3. OM浓度的戊醇与戊酸的反应为例， 分析不同反应温度对初始酯化速率的影响，结果如图9所示。当反应温度为50 °C时，初始酯 化速率最大。
[0065] (4)、反应温度对酯化率的分析
[0066] 按照标准反应体系，以脂肪酶SSL1970催化3. OM浓度的戊醇与戊酸的反应为例， 在50°C的条件下分析不同温度对酯化率的影响，结果如图10所示。在各种反应温度的条 件下，酯化率均能达到100% ;而当反应温度为50°C或者60°C时，由于反应的初始速率比较 快，反应在短时间内便达到最高的酯化率。
[0067] 以上所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明，所 述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内 容虽然并未在说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
【权利要求】
1. 一种脂肪酶SSL1970,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述的脂肪酶SSL1970的基因。
3. 根据权利要求2所述的编码脂肪酶SSL1970的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的编码脂肪酶SSL1970的基 因。
5. -种含有权利要求4所述的表达载体的微生物。
6. 权利要求1所述的脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟基进行脱水缩 合反应产生酯类化合物中的应用。
7. 根据权利要求6所述的脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟基进行 脱水缩合反应产生酯类化合物中的应用，其特征在于，所述的酯类化合物，为乙酸、丙酸、丁 酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸分别与乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊 醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇合成相应的中短链脂肪酸酯化合物，或月桂酸、十四酸、软 脂酸分别与丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成相应的长链脂肪酸酯化合物。
8. 根据权利要求6或7所述脂肪酶SSL1970在催化多种酸的羧基与多种醇的羟基进行 脱水缩合反应产生酯类化合物中的应用，其特征在于，脂肪酶SSL1970在催化反应体系中 的用量为l〇g/L。
【文档编号】C12P7/62GK104480084SQ201410842886
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】胡云峰, 梁甲元, 张云, 孙爱君, 邓盾 申请人:中国科学院南海海洋研究所