一种水稻SBP-box转录因子基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了水稻SBP-box转录因子基因及其应用。本发明具体涉及包含具有SEQIDNO.1核苷酸序列及SEQIDNO.2氨基酸序列；该转录因子的编码序列及包含该编码序列的载体或宿主。本发明还涉及提高植物耐盐性的方法和筛选具有高耐盐性植物的方法。本发明提供了改善和研究植物耐盐性的新方法，具有广阔的应用前景。
【专利说明】-种水稻SBP-box转录因子基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及水稻 SBP-box蛋白转录因子基因及其编码的蛋白或多肽在增强植物耐盐性中的应用，以及通过 抑制所述基因或其表达的蛋白来改进植物对盐胁迫的抗性的方法及转基因植物。
【背景技术】
[0002] 全球粮食需求的增加和耕地面积的不断减少对各国粮食安全形成持续的压力。在 粮食生产中，盐碱是主要的非生物胁迫，每年造成农作物大量减产及品质下降。
[0003] 有资料表明，中国农田的盐碱化也是减产、低产的主要原因之一。盐碱已成为我国 农业面临的严重问题。
[0004] 因此，如何提高作物对盐碱的抗性能力对于提高产量，解决中国乃至世界的粮食 问题具有重大的意义，对于这些非生物逆境的研究是植物研究领域最迫切且最具挑战性的 工作之一。
[0005] 目前已经有一部分耐盐相关基因包括一些转录因子被克隆，而且通过基因工程技 术获得一些抗逆植物或作物品系。抗逆基因工程就是通过调控基因的转录表达来改善植物 的抗逆能力，而在转录水平的调控中，转录因子起着关键作用。
[0006] 目前，已发现一些参与胁迫应答基因表达的转录因子。但是，由于有众多的转录因 子参与复杂的植物逆境响应过程，现在所发现的参与胁迫应答基因表达的转录因子只是一 小部分，尚有大量转录因子有待发现和研究、并进一步应用于作物抗逆分子育种。
[0007] 因此，本领域迫切需要对参与胁迫应答基因表达的转录因子进行研究，开发出可 用于作物抗逆育种的新方法和新品种，从而提高作物产量和品质。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一正是提供一种与植物(尤其是作物）耐盐性密切相关的基 因--水稻SBP-box蛋白转录因子SST，明确了该转录因子是植物耐盐性的负调控因子。本 发明的另一目的是为增强植物对盐碱胁迫的抗性提供了一种途径。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 在本发明的第一方面，提供了一种水稻SBP-box转录因子基因，所述基因命名为5^7基 因，其序列选自如下一组： 1) 至少含有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；或 2) 任一种与SEQIDNO. 1互补的核苷酸序列；或 3) 在SEQIDNO. 1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位 基因或衍生物，且编码具有相同功能蛋白质的序列。
[0010] 其编码如下蛋白质： (a) 具有SEQIDN0. 2氨基酸序列； (b) 将SEQIDN0. 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的多肽，且具有提高植物感盐性的由（C)衍生的多肽； (c)具有SBP结构域，且具有提高植物感盐性的（a)或（b)中所述多肽的同源多肽。
[0011] 在一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。
[0012] 在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔 属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选禾本科植物。
[0013] 在另一个优选例中，所述植物选自：水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉 花或油菜，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗或高粱。
[0014] 在另一优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。
[0015] 在本发明的第二方面中，提供了一种载体，它含有本发明的所述基因。
[0016] 在一个优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺 乳动物细胞病毒，优选？04觀从1300、？￡6---1、？81121、？041?从1301、？041?从2301 或1)冊， 更优选PCAMBIA1300。
[0017] 在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的载 体或基因组。
[0018] 在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优 选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆 菌，所述农杆菌包括但不限于：EHA105、S0UP1301或C58,优选EHA105。
[0019] 在本发明的第四方面，提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括抑制本 发明的SBP-b 〇X转录因子、抑制本发明的多核苷酸的表达。
[0020] 在一个优选例中，所述抑制包括使得本发明转录因子或本发明的多核苷酸序列发 生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加，从而使得所述植株具有提高的耐盐性。
[0021] 在另一优选例中，所述方法还包括使得通过上述方法获得的具有提高耐盐性的植 株与非转基因植物或其它转基因植物杂交。
[0022] 在另一优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。
[0023] 在本发明的第五方面，提供了本发明的SBP-box转录因子或核苷酸序列的抑制剂 或非保守性突变序列在提高植物耐盐性中的用途。
[0024] 在另一优选例中，所述非保守性突变序列使得包含所述非保守性突变序列的植株 中本发明锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的翻译或表达受到抑制，从而使其耐盐性优于不 包含所述非保守性突变的野生型植株。
[0025] 在本发明的第六方面，提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括： (A)提供本发明的SBP-box转录因子或核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列； (B)对植物进行选自下组的一种或多种处理：（i)将所述非保守性突变序列导入植物；或 (ii)设计针对所述非保守性突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含所述非保守性突 变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述非保守性突变 序列的个体。
[0026] 在本发明的一个优选例中，所述分子标记为序列如SEQ ID N0. 3和SEQ IDN0. 4所 示的引物对，和序列如SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6所示的引物对。
[0027] 在本发明的第七方面，提供了一种制备转基因植物的方法，所述方法包括： (1)用含有本发明SBP-box转录因子的非保守性突变序列或本发明多核苷酸的非保守 性突变序列的构建物转化植物细胞、组织或器官； (2) 选择转入所述非保守性突变序列的植物细胞、组织或器官；和 (3) 将步骤（2)中的植物细胞、组织或器官再生成植株， 其中，所得的转基因植物的耐盐性较未转化的植物有所增强。
[0028] 在另一优选例中，所述方法还包括使所得的转基因植物与非转基因植物或其它转 基因植物杂交，从而获得包含所述非保守性突变序列的杂交后代，所述杂交后代的耐盐性 较未转化的植物有所增强，优选所述杂交后代具有稳定的遗传性状。
[0029] 在另一优选例中，所述方法还包括用设计针对所述非保守性突变序列的分子标记 对转基因植物的杂交后代进行筛选，以获得具有改良的耐盐性的植物。
[0030] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
[0031] 本 申请人:通过长期而深入的研究，发现了一种水稻SBP-box转录因子基因必八苗 期耐盐相关基因55T(SeedlingSaltTolerancegene),并证明了该基因为耐盐的负调控 因子，可控制植物耐盐性，其表达抑制可增强植物对盐胁迫的抗性，因而在植物的耐盐等抗 逆性的分子育种中起重要作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。
[0032] 具体而言，本发明人通过在盐胁迫下大规模筛选水稻突变体库(伽马射线诱变）和 图位克隆技术克隆了控制水稻耐盐的基因5^7。5^7基因的基因组长度为2172 bp，有两个 内含子，全长〇RF (open reading-frame)长度为1281 bp。该基因编码426个氨基酸、约 44 KDa的具有保守SBP-box结构域的蛋白，该蛋白为一个转录因子。
[0033] 表型鉴定结果表明该基因的突变体(例如5^7基因存在1个碱基缺失，引起移码突 变，且提前终止）表现耐盐。
[0034] 通过上述研究表明：必7基因为耐盐的负调控因子，其表达抑制可增强植物对盐 胁迫的抗性，该特性可用于生产对盐胁迫抗性明显提高的转基因植物。因此，5^7基因在提 高作物对盐等逆境胁迫能力方面具有较大的应用潜力。
[0035] 并且，数据库搜索（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)发现，在短花药野生稻 iOryza brachyantha、、谷子iSetaria italica、、属染{Sorghum bicolor)、A、轰iTriticum aestivum)、玉米QZea mays)、大轰iMordeum vulgare)、乌也兄戰轰ijriticum urartu)、 二穗短柄草CSracAjpot/itt? 节节麦等基因组中都有同 源基因。蛋白的相似性从81. 2% - 56. 5%。这些同源基因都具有保守的SBP-box结构域，推 测其它植物(优选禾本科植物）的5^7同源基因具有与水稻5^7基因相似的功能。
[0036]SST蛋白或多狀及其编码序列 在本发明中，术语"SST蛋白或多肽"、基因编码的蛋白质或多肽"或"SBP-box蛋 白转录因子"是指由本发明的5^7基因编码的蛋白质或多肽，该定义中也包括所述蛋白质或 多肽的保守性变异多肽、或其同源多肽。它们均具有SBP-domain结构域，且所述蛋白或多 肽表达受到抑制后，可提高植物盐胁迫抗性。
[0037] 所述SST蛋白质或多肽的序列可选自：（a)具有SEQIDN0. 2氨基酸序列的多肽； (b)将SEQIDN0. 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的， 且具有提高植物感盐性的由（a)衍生的多肽；或（c)具有SBP-domain结构域，且具有提高 植物感盐性的（a)或（b)中所述多肽的同源多肽。
[0038] 本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重 组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。本 发明中SST蛋白或多肽优选由禾本科植物(优选水稻基因或其同源基因或家族基因编 码。
[0039] 本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个， 较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个）氨基 酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20以内， 较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的SST蛋白质或多 肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有增强植物重金属或盐胁迫抗性的活性。 本领域技术人员可根据本领域常识和/或常规试验很容易地确定这些变异方式，而不会影 响蛋白或多肽的活性。
[0040] 在本发明中，"保守性变异多肽"指与SEQ ID N0. 2的氨基酸序列相比，有至多20 个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸 所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生：
【权利要求】
1. 一种水稻SBP-box转录因子基因，其特征在于，所述基因命名为5^7基因，其序列选 自如下一种： 1) 至少含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或 2) 任一种与SEQ ID NO. 1互补的核苷酸序列；或 3) 在SEQ ID NO. 1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位 基因或衍生物，且编码具有相同功能蛋白质的序列。
2. 如权利要求1所述的水稻SBP-box转录因子基因，其编码如下蛋白质： (a) 具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列； (b) 将SEQ ID NO. 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的多肽，且具有提高植物感盐性的由（c)衍生的多肽； (c) 具有SBP结构域，且具有提高植物感盐性的（a)或（b)中所述多肽的同源多肽。
3. 含有权利要求1或2所述基因的载体。
4. 含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5. -种含有权利要求1或2任一项所述的基因在增强植物耐盐性基因工程中的应用。
6. -种含有权利要求1或2任一项所述的基因在增强植物耐盐性分子标记辅助育种中 的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450744SQ201410843389
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】兰涛, 吴为人, 张淑君, 汪斌, 刘婷婷, 林格格, 官华忠 申请人:福建农林大学