一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法
【专利摘要】一种利用离子交换纤维固定果糖基转移酶制备方法，是利用弱碱性阴离子交换纤维为载体把液态游离果糖基转移酶固定化于载体上，使用固定化果糖基转移酶活力能够长期保存且能的重复长期使用。本发明包括两部份技术内容，利用生物溶菌酶制备液态游离果糖基转移酶和利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶；米曲霉发酵培养得大量菌体，经洗涤、利用纤维酶溶解菌体、提取游离酶液、用离子交换纤维固定化果糖基转移酶，所得制得固定化酶活力≥180U/g、半衰期≥40次，转化蔗糖转化率≥90%，转化蔗糖生成低聚果糖含量55～60%。与目前公开技术相比具有酶提取简洁、操作时间短、容易再生利用、固定化过程不使用交联剂、产品质量安全性高等优点。
【专利说明】一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种果糖基转移酶固定化方法，具体是一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，果糖基转移酶高活性菌丝体发酵、酶法细胞分解提取酶液、离子交换纤维固定化果糖转移酶。
【背景技术】
[0002]离子交换纤维(1n Exchange Fiber,简称IEF)是一种纤维状离子交换材料，离子交换纤维作为新型功能高分子材料，具有独特的化学及物理吸附和分离功能，在一些相关领域有着不可代替的作用。离子交换纤维具有以下特点:形状多样，可制成长短纤维，也可织布编网，易于制成各种组件，并可根据其应用目的而选择其最好的形状、交换容量大、比表面积大、交换速度快，一般能达到颗粒状树脂的20倍，并且具有吸附效率高、易于再生等优点、再生速度快，循环使用次数多，使用中纤维损耗低。在生物酶固定化领域是利用带胺基的离子交换纤维与酶的之间的静电引力来实现接枝方式进行固化，是新型的生物酶固定化载体材料。
[0003]果糖基转移酶(fructosyltransferase, FTase , EC2.4.1.9)能催化水溶液蔗糖分子内转移生成蔗果低聚糖。其酶促反应机理:当以蔗糖为底物时，最初只有蔗果三糖(GF2 )和葡萄糖(G)生成:2GF — GF2+ G,但随着反应进行下去，蔗果三糖(GF2 )和蔗果四糖(GF3 )也可以作为反应底物，其反应分别是:2GF2 — GF3 + G; 2GF3 — GF4(蔗果五糖)+ G，也可用一个反应方程式来描述FTase的酶促反应:GFn + GFn — GFn +工+ GFn-1，是工业上酶法转化蔗糖制备低聚果糖(FOS)的关键酶。酶是否能回收再次使用是各研究机构及企业研究重点，其中，把果糖基转移酶固定于特定载体上是最有效的途径。如中国专利CN01128345.9公开了阐述了一种以蔗糖为原料，工业化生产蔗果低聚糖(低聚果糖)方法，它包括固定化果糖基转移酶制剂的工业化生产以及利用该酶制剂进行工业化生产FOS两部分:一、选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株，在合适的培养基中培养，然后将培养得到的大量菌丝体进行破壁，用离心法和超滤法将酶分离纯化，再用壳聚糖或树脂为载体以戊二醛为交联试剂将酶固定下来，固定化条件:PH=4?9，温度=10?60°C，搅拌转速=20?100r/min，酶活与载体比=20?160U，交联剂戊二醛浓度=0.05?0.3%。固定化果糖基转移酶可重复使用多次；二、分批反应法或柱式反应法以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖；采用本发明方法得到的蔗果低聚糖产品不必经过活性碳脱色，不需离子交换柱脱盐，可以获得Brix彡75，固形物中总低聚糖彡50%的FOS糖浆；中国专利CN200910094419.7公开一种新型果糖基转移酶固定化方法，包括下列步骤:(I)向壳聚糖醋酸溶液中加入0.01%?0.05%粘合剂聚乙烯吡咯烷酮；(2)将上述壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的NaOH溶液中，制备壳聚糖球形颗粒，并将壳聚糖球形颗粒用蒸馏水洗涤至中性；(3)将中性壳聚糖球形颗粒置于pH = 7的磷酸缓冲液中，加入戊二醛交联剂，使之键合在壳聚糖球形颗粒上，并充分洗涤，以除掉未键合的戊二醛；(4)将键合了戊二醛的壳聚糖球形颗粒置于PH = 7磷酸缓冲液，然后向其中加入果糖基转移酶，使之固定化；本发明固定了果糖基转移酶，提高了壳聚糖作为固定化酶载体的机械强度，提高了酶负载量；中国专利CN200910026901.7公开一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，属于固定化果糖基转移酶的【技术领域】。本发明包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分，本发明筛选出了大孔阴离子树脂D380、D296R、或D301-1II为载体，以戊二醛为交联剂，采用先吸附后交联的方法进行固定化。载体材料价格低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，树脂吸附酶间接起到提取作用，因此对于粗酶液的纯度没有过高的要求，有利于工业化生产，所得固定化酶酶活回收率可达81.2%以上，可循环使用10次。
[0004]以上几种固定化果糖基转移酶比游离酶有较好工业应用前景，实现了可回收重复使用特点，但是以上几种方法都存在制备较繁杂，固定化后活性不高、固定化酶半衰期短、使用较多化学试剂、使用具有毒性戊二醛作交联剂，由于反应过程中部酶脱落造成戊二醛游离出对产品有食品安全风险，固定化酶机械抗性差等不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，它能够提固定化回收率、固定化酶活性高、半衰期长、安全性高、不使用化学试剂等优点。
[0006]本发明通过以下技术方案实现上述目的:一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
(1)高含果糖基转移酶菌丝体制备:米曲霉(Aspergillusoryzae)在温度=28?33°C,pH=4.5?6.5，时间=36?42h，通气量为0.15VVM，转速=150r/min条件下大量发酵得到菌丝体，经分离洗涤得到干净菌丝体；
(2)游离果糖基转移酶液制备:将步骤(I)制得的干净菌丝体置于搅拌罐内，添加2?4倍(W/W)重量的纯化水和1.5?2%(W/W)活力10?15万/g的固定化纤维酶，搅拌罐搅拌转速=50?80r/min，操作温度=30°C，反应5?8h后离心分离，离心机为上卸料式，离心半径=400_，电机转速=1400?1500r/min,，离心分离取液体得到游离果糖基转移酶；
(3)固定化载体处理:选用粒度均匀的弱碱性阴离子交换纤维，用食品级乙醇，浓度=55?70% (V/V)浸泡40?60min，分离回收乙醇，然后用纯化水洗涤离子交换纤维2?4次后备用；
(4)固定化:将步骤(2)得到的游离果糖基转移酶添加至固定化反应罐内并按每300U?400U酶活力加入I?1.5g离子交换纤维载体，固定化温度=25?28°C，PH值=5.5?
6.5,搅拌转速=35?45r/min,吸附时间=2?3h,过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶；
(5)冷藏:冷藏的目的是稳定吸附提升固定化，将步骤(4)所得固定化果糖基转移酶置于2?5°C冷库内保存4?6h，用纯化水冲洗3?4次，即得到高活性固定化果糖基转移酶。
[0007]本发明突出的优点在于:
(I)利用带胺基的离子交换纤维与酶的之间的静电引力来实现接枝方式进行固化，不使用具有毒性戊二醛交联剂，确保固定化果糖基转移酶使用安全性且提高固定化果糖基转移酶的半衰期。利用离子交换纤维具有交换容量大、比表面积大、交换速度快、循环使用次数多、使用过程中纤维损耗低等优点成功实现了离子交换纤维固定化果糖基转移酶，并提高固定化回收率、固定化酶活性。
[0008](2)使用酶法破碎菌丝体细胞，避免使用机械破碎过热导致酶失活、超声波破碎法设备投资大等缺点。
[0009](3)工艺简洁、设备成熟、操作方便适合工业化应用。
【具体实施方式】
[0010]以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0011]实施例1
米曲霉(Aspergillus oryzae)在温度=28°C,ρΗ=4.5,时间=36h,通气量为 0.15VVM,转速=150r/min条件下发酵、分离洗涤得到干净菌丝体置于搅拌罐内，添加2倍(W/W)重量的纯化水和1.5%(ff/ff)活力10万U/g的固定化纤维酶，搅拌转速=50r/min，操作温度=30°C，反应5h，用离心半径=400mm，电机转速=1400r/min的离心机分离取液体得到游离果糖基转移酶并置于固定化反应罐内，按每酶活力=300U加入Ig用浓度=55% (V/V)食品级乙醇浸泡40min，纯化水洗涤2次的弱碱性阴离子交换纤维。固定化温度=25°C，PH值=5.5，搅拌转速=35r/min，吸附时间=2h后过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶；所得固定化果糖基转移酶置于2°C冷库内保存4h，用纯化水冲洗3次，得到固定化果糖基转移酶。按GB/T23528-2009附录B方法检测固定化果糖基转移酶活力=255U/g，蔗糖转化率=92%，低聚果糖含量=59.2%,间歇式转化鹿糖试验得到半衰期=45次。
[0012]实施例2
米曲霉(Aspergillus oryzae)在温度=33°C, ρΗ=5.5,时间=42h,通气量为 0.15VVM,转速=150r/min条件下发酵、分离洗涤得到干净菌丝体置于搅拌罐内，添加4倍(W/W)重量的纯化水和2.0%(W/W)活力15万U/g的固定化纤维酶，搅拌转速=50r/min，操作温度=30°C,反应8h,用离心半径=400mm,电机转速=1500r/min的离心机分离取液体得到游离果糖基转移酶并置于固定化反应罐内，按每酶活力=400U加入1.5g用浓度=70% (V/V)食品级乙醇浸泡60min，纯化水洗涤4次的阴性弱碱性离子交换纤维。固定化温度=28°C，PH值=6.5，搅拌转速=45r/min，吸附时间=3h后过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶；所得固定化果糖基转移酶置于5°C冷库内保存6h，用纯化水冲洗4次，得到固定化果糖基转移酶。按GB/T23528-2009附录B方法检测固定化果糖基转移酶活力=245U/g，蔗糖转化率=91.8%,低聚果糖含量=60.6%间歇式转化鹿糖试验得到半衰期=42次。
[0013]实施例3
米曲霉(Aspergillus oryzae)在温度=31°C, ρΗ=5.5,时间=38h,通气量为 0.15VVM,转速=150r/min条件下发酵、分离洗涤得到干净菌丝体置于搅拌罐内，添加3倍(W/W)重量的纯化水和2.0%(W/W)活力12万U/g的固定化纤维酶，搅拌转速=60r/min，操作温度=30°C,反应5h,用离心半径=400mm,电机转速=1500r/min的离心机分离取液体得到游离果糖基转移酶并置于固定化反应罐内，按每酶活力=320U加入1.2g用浓度=60% (V/V)食品级乙醇浸泡45min，纯化水洗涤3次的阴性弱碱性离子交换纤维。固定化温度=26°C，PH值=6.0，搅拌转速=40r/min，吸附时间=3h后过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶；所得固定化果糖基转移酶置于4°C冷库内保存6h，用纯化水冲洗2次，得到固定化果糖基转移酶。按GB/T23528-2009附录B方法检测固定化果糖基转移酶活力=250U/g，蔗糖转化率=91.8%,低聚果糖含量=59.5%间歇式转化鹿糖试验得到半衰期=43次。
[0014]实施例4
米曲霉(Aspergillus oryzae)在温度=30°C, ρΗ=5.2,时间=40h,通气量为 0.15VVM,转速=150r/min条件下发酵、分离洗涤得到干净菌丝体置于搅拌罐内，添加3倍(W/W)重量的纯化水和1.8%(W/W)活力14万U/g的固定化纤维酶，搅拌转速=50r/min，操作温度=30°C,反应6h,用离心半径=400mm,电机转速=1400r/min的离心机分离取液体得到游离果糖基转移酶并置于固定化反应罐内，按每酶活力=350U加入1.4g用浓度=65% (V/V)食品级乙醇浸泡50min，纯化水洗涤3次的阴性弱碱性离子交换纤维。固定化温度=26°C，PH值=5.3，搅拌转速=40r/min，吸附时间=2h后过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶；所得固定化果糖基转移酶置于3°C冷库内保存5h，用纯化水冲洗3次，得到固定化果糖基转移酶。按GB/T23528-2009附录B方法检测固定化果糖基转移酶活力=235U/g，蔗糖转化率=90.9%,低聚果糖含量=58.5%,间歇式转化鹿糖试验得到半衰期=44次。
【权利要求】
1.一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)高含果糖基转移酶菌丝体制备:经米曲霉(Aspergillusoryzae)大量发酵得到菌丝体，经分离洗涤得到干净菌丝体； (2)游离果糖基转移酶液制备:将步骤(1)制得的干净菌丝体置于搅拌罐内，添加2?4倍(W/W)重量的纯化水和1.5?2%(W/W)的活力为10?15万U/g固定化纤维酶，反应5?8h，离心分离取液体得到游离果糖基转移酶； (3)固定化载体处理:选用粒度均匀的离子交换纤维，用食品级乙醇处理40?60min，然后用纯化水洗涤2?4次后备用； (4)固定化吸附:将步骤(2)得到的游离果糖基转移酶添加至固定化反应罐内并同时加入定量的离子交换纤维，吸附2?3h，过滤取固体物得到固定化果糖基转移酶； (5)冷藏稳定吸附提升固定化:将步骤(4)所得固定化果糖基转移酶置于2?5°C冷库内保存4?6h，纯化水冲洗3?4次，即得到高活性固定化果糖基转移酶。
2.根据权利要求1所述的离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)米曲霉(Aspergillus oryzae)发酵产酶，温度=28?33°C,pH=4.5?6.5,时间=36?42h,通气量为0.15VVM。
3.根据权利要求1所述离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于所述步骤(2)搅拌罐搅拌转速为50?80r/min,离心机为上卸料式，离心半径=400mm,电机转速=1400?1500/min，操作温度=30°C。
4.根据权利要求1所述的离子交换纤维固定化果糖基转移酶制备方法，其特征在于，所用离子交换纤维是弱碱型，所述步骤(3)食品级乙醇浓度=55?70% (V/V)。
5.根据权利要求1所述离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)固定化温度=25?28°C，PH=5.5?6.5，搅拌转速=35?45r/min，每300?400U活力加入1?1.5g离子交换纤维载体，吸附时间=2?3h。
6.根据权利要求1所述的离子交换纤维固定化果糖基转移酶制备方法，其特征在于，所述步骤(5)固定化果糖基转移酶置于冷藏温度=2?5°C，时间=4?6h，纯化水洗涤即得到高活性固定化果糖基转移酶。
【文档编号】C12R1/69GK104450662SQ201410847613
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】方昱 申请人:临沂市宏昱生物科技有限公司