一种热稳定性及比酶活提高的碱性α-淀粉酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种热稳定性及比酶活提高的碱性α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用。它是在GenBank登录号为KF451925.1的碱性α-淀粉酶基因Amy703基础上，缺失其N端669个核苷酸(223个氨基酸)，得到碱性α-淀粉酶突变体基因N-Amy703，将其转化大肠杆菌构建成基因工程菌，经诱导表达、纯化得到高热稳定性高比酶活的碱性α-淀粉酶突变体N-Amy703。突变体比酶活提高到170.15U/mg，是突变前的40倍；其在50℃的t1/2为28min，比突变前的t1/2提高了近4倍。同时其最适反应温度提高了10℃。本发明提供的N-Amy703酶学性质有大幅度改善，更适用于工业生产应用。
【专利说明】一种热稳定性及比酶活提高的碱性α-淀粉酶突变体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种热稳定性及比酶活提高的碱性α -淀粉酶突变体及其构建方法和应用，属于遗传工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]α -淀粉酶（EC 3. 2. I. I)属于糖苷水解酶13家族（GH13)，能催化水解淀粉及相关多聚物内部的α-1，4-糖苷键，分布于植物、动物及微生物中。α-淀粉酶因能水解淀粉及相关多聚物产生α异头物的单糖或寡糖，或通过转糖苷作用形成α糖苷键，是最早实现工业化生产并且是迄今为止用途最广、产量最大的商品化酶，占全球酶制剂市场份额的25%?33%，尤其是酸性淀粉酶已广泛应用于淀粉原料液化、青贮饲料、白酒酿造、烘焙等工业化生产中。此外，在碱性溶液中表现出最佳活性的碱性α-淀粉酶可应用于造纸和纸浆工业中的淀粉改性，以及作为洗涤添加剂去除淀粉类污渍，作用日益突出。
[0003]由于在高温下反应具有减少微生物污染、增加底物溶解度及降低粘度等优点，工业生产过程一般要求在高温下进行。同时，比酶活较高的酶转化等量底物或产生等量产物所需要的酶更少，时间更短。
[0004]来自于Bacillus pseudofirmus 703的碱性α -淀粉酶Amy703 (氨基酸序列的GenBank登录号为AGT54942)，其在pH 9. O，40°C时具有最高酶活，在碱性pH (8. O?10.5)条件下稳定，在50°C处理20min后，残余酶活为18. 5%，在大肠杆菌中诱导表达、Ni柱纯化后的比酶活为4. 93U/mgo但碱性α -淀粉酶Amy703的比酶活与热稳定性还需进一步提高，以满足工业生产提高效率节约能源的要求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是利用基因技术改造GenBank登录号为AGT54942的碱性α -淀粉酶，提高其比酶活、热稳定性，进一步适应工业生产的更高要求。
[0006]本发明是这样实现的。在GenBank登录号为KF451925. I的碱性α -淀粉酶基因Amy703，其对应的氨基酸序列收录号为AGT54942的基础上，设计引物（FP和RP)进行PCR，获得缺失N端669个核苷酸的α-淀粉酶突变体基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示；
[0007]所述引物为：FP:5’CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3’
[0008]RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’。
[0009]本发明的重组碱性α -淀粉酶Amy703的构建方法，具体包括如下步骤：
[0010]I)采用化学全合成或PCR方法克隆得到GenBank登录号为KF451925. I的碱性α -淀粉酶基因Amy703。
[0011 ] 2)将Amy703基因片段连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，得到重组载体pET28a-Amy703 ；
[0012]3)设计缺失Amy703基因N端669个核苷酸的突变引物FP和RP，以重组载体pET28a-Amy703 为模板，进行 PCR ；
[0013]FP: 5 ’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3’
[0014]RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’
[0015]PCR 反应体系：10XEx Taq buffer, 5 μ I ；dNTP (2. 5mM), 5 μ I ；突变引物FP (10 μ Μ)，2 μ I ;突变引物 RP (10 μ Μ)，2 μ I ;Ex Taq, O. 3 μ I ;模板，I μ I ;加 ddH20 至50 μ Io
[0016]空白对照：将以上体系中的DNA模板换成ddH20，其他不变。
[0017]PCR扩增体系：94°C，5min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，2min 15s，25 个循环；72°C，7min ；12°C, ；
[0018]4)将步骤3)获得的PCR产物用0. 7%的琼脂糖凝胶回收后，连接T载体pMD18_T，通过测序验证，得到碱性α-淀粉酶突变体基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示;
[0019]5)将N_Amy703基因片段用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，酶切体系为：BamH I ,0. 5 μ I ；Xho I，O. 5 μ I ;10XK buffer，5 μ I ;PCR 回收产物，30 μ 1，加 ddH20 至50 μ I，37°C处理2h后，用O. 7 %的琼脂糖凝胶回收，与经过同样方式处理后的载体pET28a在16°C酶连2h，酶连体系为：酶切片段，1.2μ1 ;酶切载体，O. 3μ1 Solution I，I. 5 μ I。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD克隆感受态细胞中，挑选两个转化子经测序得到N端669个核苷酸缺失的重组载体pET28a-N-Amy703 ；
[0020]6)将步骤5)获得的重组载体pET28a-N-Amy703转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到产碱性 α -淀粉酶 N-Amy703 的重组菌株 BL21 (DE3) -pET28a-N_Amy703 ；
[0021]7)将菌株BL21 (DE3) -pET28a-N-Amy703按照常规的大肠杆菌诱导表达重组蛋白方法，获得重组蛋白N-Amy703，分析碱性α -淀粉酶突变体N_Amy703的酶学性质。
[0022]所述发酵培养基组成成分为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L。
[0023]本发明通过PCR方法缺失Amy703基因的N端669个核苷酸得到N_Amy703，并将其连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态中，筛选到重组载体pET28a-N-Amy703 (图I)并转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株，经诱导表达、破菌、纯化获得碱性α -淀粉酶突变体N-Amy703 (图2)，对N_Amy703进行酶学性质分析，发现其在50°C处理20min后，残余酶活从原始酶Amy703的18. 5%提高到72. 2% (图4)。同时，比酶活从原始酶Amy703的4. 93U/mg，提高到170. 15U/mg，提高了近40倍。突变体N_Amy703最适反应温度和最适pH分别从Amy703的40°C ,pH 9.0提高到50°C，pH 9. 5。这为碱性α -淀粉酶的应用奠定了良好的基础。
[0024]淀粉酶酶活力（U)定义方法：在最适反应条件下，I分钟内转化生成I微摩尔产物所需的酶量为一个活力单位（U)。
[0025]检测碱性α -淀粉酶比酶活（U/mg)的定义方法：原始酶（Amy703)与突变体(N-Amy703)通过相同方式纯化后（Ni柱纯化），每毫克纯化蛋白所具有的酶活力。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图l:(a)目的基因的扩增。M ： λ-EcoTH I digest DNA Marker ; I :PCR 扩增条带；
[0027](b)重组质粒检测。M:A-EcoT14 I digest DNA Marker ；I :重组质粒酶切条带。
[0028]图2 ：SDS-PAGE电泳检测纯化后的碱性α -淀粉酶突变体。M :蛋白质分子量标准；I :纯化的碱性α-淀粉酶突变体条带。
[0029]图3 :原始酶Amy703的热稳定性：将纯化后的酶在不同温度下处理20min后，测定残余酶活。
[0030]图4 :突变体N-Amy703的热稳定性：将纯化后的酶在不同温度下处理20min后，测定残余酶活。
【具体实施方式】
[0031]实施例I
[0032]I)采用PCR方法克隆得到GenBank登录号为KF451925. I的碱性α -淀粉酶基因Amy703。将Amy703基因片段连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，得到重组载体pET28a-Amy703 ；
[0033]2)以重组载体pET28a-Amy703为模板，使用突变引物FP和RP进行PCR ；
[0034]FP: 5? CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3，
[0035]RP:5’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’
[0036]PCR 反应体系：10 X Pyrobest buffer, 5 μ I ；dNTP (2. 5mM)，5 μ I ;突变引物FP(10yM),2yl ;突变引物 RP (10 μ Μ)，2 μ I ；Pyrobest, O. 3 μ I ;模板，Ιμ? ;加 ddH20 至50 μ Io空白对照：将以上体系中的DNA模板换成ddH20，其他不变。
[0037]PCR扩增体系：94°C,5min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，2min 15s，25 个循环；72°C,7min ；12°C, ；
[0038]3)将步骤2)获得的PCR产物用0. 7%的琼脂糖凝胶回收后，连接T载体pMD18_T，通过测序验证，得到碱性α-淀粉酶突变体基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。N-Amy703基因片段用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，酶切体系为：BamH I，O. 5 μ I ；Xho I，0· 5 μ I ；10ΧΚ buffer, 5 μ I ;PCR 回收产物，30 μ 1，加 ddH20至 50 μ 1,37°C处理2h后，用O. 7 %的琼脂糖凝胶回收，与经过同样方式处理后的载体pET28a在16 °C酶连2h，酶连体系为：酶切片段，1.2μ1 ;酶切载体，O. 3μ1 Solution I，I. 5 μ I。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD (Invitrogen公司）克隆感受态细胞中，挑选两个转化子经测序得到N端669个核苷酸缺失的重组载体pET28a-N-Amy703 ；
[0039]4)将步骤3)获得的重组载体pET28a-N-Amy703转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到产碱性α -淀粉酶突变体N-Amy703的重组菌株BL21 (DE3)-pET28a-N_Amy703 ；
[0040]实施例2碱性α -淀粉酶突变体的诱导表达及纯化
[0041]将实施例I的重组菌株BL21 (DE3) -pET28a-N_Amy703接种到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm条件下培养至OD6tltl= O. 8，加入IPTG至终浓度为O. 5mM，18°C、200rpm条件下诱导12h。离心收集菌体，超声波破菌，离心去上清，过Ni柱纯化，用超滤管浓缩，得到纯化后的碱性α -淀粉酶突变体蛋白，SDS-PAGE检测。
[0042]实施例3碱性α -淀粉酶突变体的酶活测定
[0043]α -淀粉酶的酶活测定方法：将纯化后的蛋白稀释适当倍数，取50 μ I稀释酶液，加到500 μ I提前预热的可溶性淀粉底物中，在指定温度下反应15min，沸水浴5min终止反应，加800 μ I DNS溶液，沸水浴lOmin，冷却后，在540nm波长处测定吸光值。空白对照为沸水浴时加入50 μ I酶液。以在最适反应条件下，每分钟生产I μ mo I/L还原糖所需的酶量作为一个酶活力单位（U)。
[0044]经实验测定，淀粉酶突变体N-Amy703在50 °C处理20min后，残余酶活从原始酶Amy703的18. 5 %提高到72. 2 %。同时，比酶活从原始酶Amy703的4. 93U/mg，提高到170. 15U/mg，提高了近 40 倍。
【权利要求】
1.一种热稳定性及比酶活提高的碱性α-淀粉酶突变体N-Amy703，其特征在于在GenBank登录号为KF451925.1的碱性α -淀粉酶基因Amy703，其对应的氨基酸序列收录号为AGT54942的基础上，设计引物FP、RP进行PCR，获得缺失N端669个核苷酸的α -淀粉酶突变体基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； 所述引物为:FP:5’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC3’
RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC3’。
2.一种热稳定性及比酶活提高的碱性α -淀粉酶突变体构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)采用化学全合成或PCR方法克隆得到碱性α-淀粉酶基因Amy703 ; 2)将步骤I)获得的碱性α-淀粉酶基因Amy703连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，得到重组载体pET28a-Amy703 ； 3)设计缺失Amy703基因N端669个核苷酸的突变引物FP和RP，以重组载体pET28a-Amy703 为模板进行 PCR，
FP: 5 ’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC3’
RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC3’ 4)将步骤3)获得的PCR产物用0.7%的琼脂糖凝胶回收后，连接到T载体pMD18-T，通过测序验证，得到权利要求1)所述的碱性α -淀粉酶突变体基因N-Amy703 ; 5)将N-Amy703基因片段用限制性内切酶BamHI和Xho I双酶切，酶切体系为:BamHI，0.5 μ I ；Xho I，0.5 μ I ；10ΧΚ buffer, 5 μ I ；PCR 回收产物，30 μ 1，加 ddH20 至 50 μ 1，37°C处理2h后，用0.7%的琼脂糖凝胶回收，与经过同样方式处理后的载体pET28a在16°C酶连2h，酶连体系为:酶切片段，1.2μ1 ;酶切载体，0.3μ1 ；Solut1n I，1.5μ1，酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD克隆感受态细胞中，挑选两个转化子经测序得到N端669个核苷酸缺失的重组载体pET28a-N-Amy703 ； 6)将步骤5)获得的重组载体pET28a-N-Amy703转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到产碱性α -淀粉酶突变体 N-Amy703 的重组菌株 BL21 (DE3)-pET28a-N_Amy703 ； 7)将菌株BL21(DE3)-pET28a-N-Amy703按照常规的大肠杆菌诱导表达重组蛋白方法，获得重组蛋白N-Amy703，分析碱性α -淀粉酶N_Amy703的酶学性质。
【文档编号】C12N15/70GK104498453SQ201410852880
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】张桂敏, 卢争辉, 马延和 申请人:湖北大学