一种人乳头瘤病毒(hpv)分型检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种能对18种人乳头瘤病毒(HPV)亚型进行分型和检测的试剂盒，属于生物【技术领域】。其包括盒体(1)、衬垫(2)、在衬垫(2)上设有数个容器孔，用于放置试管，试管中分别装有缓冲液A(3)、MgCl2(4)、dNTP(5)、ddH2O(6)、HotstarTaq聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、缓冲液B(10)、SAP酶(11)、缓冲液C(12)、iPlex终止反应液(13)、iPlex酶(14)、延伸引物(15)。本实用新型可解决现有检测方法不能分型、不能区分单独感染和混合感染、假阳性高、准确率低以及通量低的缺陷，具有分型检测结果快速、准确、灵敏度高并且通量高的优点。
【专利说明】一种人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物【技术领域】，具体涉及到一种能用于分型和检测18种人类乳头瘤病毒(HPV)亚型的试剂盒，可以用于妇女人乳头瘤病毒(HPV)感染的高通量筛查和宫颈癌等癌症致病机理的研究。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种嗜上皮病毒,感染人体皮肤及粘膜复层鳞状上皮。HPV感染引起多种良性和恶性肿瘤。据估计，大约有5.2%的人患癌症与HPV感染有关，包括 90-93 %的肛门癌，12-63 %的口咽癌，36-40 %的阴茎癌，40-51 %的会阴癌，40-64%的阴道癌和99.7%的宫颈癌等。到目前为止，已经确定的HPV亚型有100多种，按其潜在的致癌能力可分为高危型(High-risk，)即￥，包括即￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82、共 15 种；疑似高危型 HPV，包括 HPV26、53 和 66，共 3种；低危型仏0￥-1^81^，1^)册￥，包括册￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81 和 CP6108 等。
[0003]HPV是一种双链闭环DNA病毒，含约8k左右碱基，编码区编码6个早期开放阅读基因El、E2、E4、E5、E6和E7，以及2个晚期开放阅读基因LI和L2。LI开发阅读框是HPVDNA基因组内最保守的基因，常被用于HPV亚型的区分和鉴定。如果一个HPV的LlDNA序列与其它HPV的LlDNA序列有超过10%的差异，就被定义为另一种亚型。不同的HPV亚型感染后引起的疾病类型有很大的差别，例如高危型HPV感染后与宫颈癌的发生有密切关系，低危型HPV的感染常引起外生殖器的湿疣等良性病变。同一种高危型HPV的持续感染大大增加了被感染者罹患宫颈癌的机会，所以对HPV基因亚型的鉴定，其意义特别重大。
[0004]到目前为止，国内各家医院的妇科检查常采用美国FDA (Food and DrugAdministrat1n)批准的杂交捕获法II (Hybrid Capture II, HC2)来检查HPV的感染情况，但此方法只能检测13种高危型HPV的存在与否，不能分型，不能区分单独感染和混合感染，而且，该方法的技术过程是通过核酸杂交来进行的，因此结果常有大量的假阳性和准确率低的缺点，此外，HC2方法成本高，通量低，所以建立一种高通量、高准确率、能够分型和价格低廉的HPV检测和鉴定的方法势在必行。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的是旨在解决现有HPV的检测方法不能分型，准确率低，通量低和价格高的缺点，利用基质辅助激光解吸收/电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)系统检测技术，开发一种人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒
[0006]本实用新型所采用的技术方案为:建立一种人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒，包括包括盒体(1)、衬垫(2)、在衬垫(2)上设有数个容器孔，用于放置试管，试管中分别装有缓冲液 A(3)、MgCL2 (4)、dNTP(5)、ddH20(6)、HotstarTaq 聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、缓冲液B (10)、SAP酶(11)、缓冲液C (12)、iPLex终止反应液(13)、iPLex酶
(14)、延伸引物(15)。
[0007]在上述的分子生物学试剂中，缓冲液A(3)装量为SOOyL5MgCL2G)的装量为100 μ L ；dNTP(5)的装量为 100 μ UddH2O (6)的装量为 500 μ UHotstarTaq 聚合酶(7)的装量为10 μ L、正向引物(8)的装量为100 μ L、反向引物(9)的装量为100 μ L、缓冲液B (10)的装量为200 μ L、SAP酶(11)的装量为10 μ L、缓冲液C (12)的装量为200 μ L、iPLex终止反应液(13)的装量为100 μ L、iPLex酶(14)的装量为10 μ L、延伸引物(15)的装量为100 μ L。
[0008]所述的衬垫设置在盒体内，衬垫上设有容器孔，用于放置装有各种试剂或引物的试管，根据试管内的内容分三个单元。其中第一单元为PCR扩增单元，含有:缓冲液Α(3)、MgCl2 (4)、dNTP (5)、ddH20 (6)、HotstarTaq 聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)。
[0009]其中正向引物(8)的序列为:
[0010]SEQ ID N0.1ACGTTGGATGTTTGTTACTGTGGTAGATACYAC
[0011]SEQ ID N0.3ACGTTGGATG ACACAACTGTGTTCACTAGC
[0012]其中反向引物(9)的序列为:
[0013]SEQ ID N0.2ACGTTGGATGGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
[0014]SEQ ID N0.4CGTTGGATG CAACTTCATCCACGTTCACC
[0015]其中SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 用于扩增 HPV 的 DNA 片段，其中 SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4用于扩增人体细胞β-球蛋白的DNA片段。
[0016]所述的第二单元为SAP酶处理单元，主要是除去扩增产物中所含有的dNTPs试剂，包含有:缓冲液B (10)、SAP酶(I I)。第三单元为延伸反应单元，在延伸引物的3’端连接一个碱基，得到分子量各不相同的延伸产物，含有缓冲液C (12)、iPlex终止反应液(13)、iPlex酶(14)、延伸引物(15)，其中延伸引物(15)的序列分别为:
[0017]SEQ ID N0.5TGTGCTGCCATATCTACTT
[0018]SEQ ID N0.6CTGTGCTTCTACACAGTCTCCT
[0019]SEQ ID N0.7CCGCAGTACTAACCTTACCATTA
[0020]SEQ ID N0.8CAATTGCAAACAGTGATACT
[0021]SEQ ID N0.9AAAGAATATATAAGACATGT
[0022]SEQ ID N0.1OTACAAATATGTCTGTGTGTTC
[0023]SEQ ID N0.11GAGTCTTCCATACCTTCTAC
[0024]SEQ ID N0.12TAGACATGTGGAGGAATATG
[0025]SEQ ID N0.13ATTACCTGTGTTGATACTAC
[0026]SEQ ID N0.14CGGTTTCCCCAACATTTAC
[0027]SEQ I D N0.15CAAATTAAACAGTATGTTAG
[0028]SEQ ID N0.16GATACTACTAGAAGTAC
[0029]SEQ ID N0.17ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGA
[0030]SEQ I D N0.18GCACCAATCTTTCTGTGTGTGC
[0031]SEQ ID N0.19TACCAGAAGCACCAACATGACTA
[0032]SEQ ID N0.20GGCATGTTGAGGAATATGATTT
[0033]SEQ ID N0.21CATGCAGAAGAGTTTGATTTA
[0034]SEQ ID N0.22GTACTAATTTAACCATTAGCACT
[0035]SEQ ID N0.23ACCTCAAACAGACACCATGG
[0036]所述延伸产物用飞行质谱(MALD1-T0F-MS)方法进行检测，根据延伸产物分子量的大小来确定HPV的分型结果，同时采用人体细胞β-球蛋白作为内参即阳性对照，用ddH20 (6)作为阴性对照。
[0037]本实用新型是充分利用基质辅助激光解吸收/电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)系统检测核酸多态型SNP的原理，设计出不同大小分子量的引物及其产物，而且确保一个反应体系中的引物之间互不干扰。该实用新型建立了一个快速，简便，成本低廉且高通量的HPV分型检测试剂盒，该试剂盒准确度高，灵敏性好，能够准确分型，且精准区分单感染和混合感染，具有很强的实用价值。
[0038]通过该试剂盒能检测的HPV 亚型包括 HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 和 HPV82，共18种。
[0039]本实用新型适应于HPV感染的流行病学调查、高危型HPV亚型的分型和检测，HPV与肿瘤发生相关性研究及宫颈癌甚至其它癌症的发生和发展的机理研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是本实用新型的结构示意图。
【具体实施方式】
[0041]以下结合实施例和附图对本实用新型的【具体实施方式】进行详细描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限制本实用新型的范围。
[0042]实施例1:利用本实用新型试剂盒对HPV进行分型和检测。
[0043]按常规方法提取并检测DNA，然后用本实用新型所述试剂盒，对样本中的HPV进行分型检测，下面为检测过程。
[0044]I)引物稀释和DNA质检
[0045]PCR扩增反应的引物稀释至终浓度为0.5μ M ;根据稀释公式，按照单碱基延伸引物的分子量将引物稀释至终浓度为7-14μΜ之间。
[0046]紫外分光光度计SMA3000测定溶液中DNA的浓度和Α260/Α280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/y L，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格的DNA置于4°C取用或-20°C保存。
[0047]2) PCR扩增反应
[0048]按下表配制PCR反应液(以I个样本为例):
[0049]
【权利要求】
1.一种人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒，其特征在于:包括盒体(I)、衬垫(2)、在衬垫(2)上设有数个容器孔，用于放置试管，试管中分别装有缓冲液A(3)、MgCL2(4)、dNTP(5)、ddH20(6)、HotstarTaq聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、缓冲液B(10)、SAP酶(11)、缓冲液C (12)、iPLex终止反应液(13)、iPLex酶(14)、延伸引物(15)。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒，其特征在于:所述的分子生物学试剂中，缓冲液A (3)装量为200 μ L ；MgCL2 (4)的装量为10yL ；dNTP(5)的装量为100 μ UddH2O (6)的装量为500 μ UHotstarTaq聚合酶(7)的装量为10 μ L、正向引物(8)的装量为100 μ L、反向引物(9)的装量为100 μ L、缓冲液B (10)的装量为200 μ L、SAP酶(11)的装量为10yL、缓冲液C(12)的装量为200 μ UiPLex终止反应液(13)的装量为100 μ L、iPLex酶(14)的装量为10 μ L、延伸引物(15)的装量为100 μ L。
3.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)分型检测试剂盒，其特征在于:能对HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 和 HPV82 共 18 种 HPV 亚型进行分型和检测。
【文档编号】C12Q1/68GK203923213SQ201420356334
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】葛世超, 张宇清, 赵旭平, 管清华 申请人:上海邃志生物科技有限公司