用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒。本发明的探针和引物共有7组，其可以准确检测人类EGFR基因上的29种常见突变。采用本发明引物和探针的试剂盒，其灵敏度高，在20ng野生型人类基因组的背景下可以检出1％的微量突变模板，减少了假阴性结果的出现。另外，所述试剂盒操作简便，可控性强，可进行大批量样品的检测，有利于临床操作。
【专利说明】用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒
【技术领域】
[OOOU 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、 探针及试剂盒。
【背景技术】
[000引 人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)基因位于人 类7号染色体短臂7pl2?14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨酸激酶（TKI) 家族，存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞。EGFR可W激活酪氨酸激酶，从而打开下 游信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程，在 肿瘤恶性生长中发挥重要作用。因此，EGFR成为肿瘤祀向治疗研究的一个重要祀点。
[000引 目前，临床上EGFR的祀向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制剂巧GFR-TU)和 单克隆抗体两种机制。其中，基于EGFR-TKI机制的吉非替巧（Gefitinib，商品名易瑞沙） 和厄洛替巧巧rlotin化，商品名特罗凯），是目前肿瘤患者最有效的祀向药物。但该些祀向 药物并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。临床研究结果表明，吉非替 巧对EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，有效率可达80%，而对野生型患者基本无 效。此外，研究表明部分EGFR-TKI类药物初始治疗有效的患者在后期会发生耐药反应，该 与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50%的EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突 变所致。
[0004]文献报道（Chan SK，et al，Eur J Cancer, 2006,42(1) ; 17-23)，EGFR 基因的酪氨 酸激酶区存在多种突变，其中29种为常见突变（见表1)，主要集中在外显子18-21上，其中 约90%存在于外显子19和21上，包括外显子19上747-750位氨基酸之间的19种常见缺 失突变约占突变的45%;外显子21上的L858点突变约占突变的40-45%，该些位点也是中 国人EGFR基因的热点突变（韩宇等，中华肿瘤学杂志，2007,29(4) ;278-282 ;郭健等，中国 肺癌杂志，2007，10化）；504-507)。
[000引由于EGFR-TKI类的祀向药物的价格昂贵，如果病人不携带EGFR突变而服用此类 药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查肿瘤患者是否携带EGFR 突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
[0006] 目前，检测肿瘤组织中的EGFR突变的方法很多，其中，国内外主要采用的是基因 测序技术。该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点；一是灵敏度低，一般需 要突变基因丰度达到10% W上才能准确检测，对于低于10%的样品出现假阴性的结果。二 是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染，导致假阳性结果的出现。
[0007] 因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高和避免交叉污染的检 测EGFR基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断的时效性要求。
[0008] 突变扩增阻滞系统（amplification refractoiy mutation system,ARM巧也叫等 位基因特异性PCR,该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技 术。由于PCR过程中引物延伸是3'端开始的，所W 3'末端的碱基对引物的延伸来说处于至 关重要的位置。根据该个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3'最 末端，当反应进行时，如果引物3'末端碱基与模板DNA序列匹配则可W扩增，如果不匹配， 则链延伸反应就会因3'，5' -磯酸二醋键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的 目的。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，其包 含下列7组引物和探针中的任意一组或多组，具体为：
[0010] (1)正向引物；5，一CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC-3，
[001U 正向引物；5 ' 一 CAAAAAGATCAAAGTGCTGA- 3，
[0012]正向引物；5，一 CAAAAAGATCAAAGTGCCGT- 3 '
[001 引 反向引物；5' 一ACAGCTTGCAAGGACTCTGG-3，
[0014]探针；5' 一FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/B册 1-3,；
[00巧](2)正向引物；5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC-3，
[0016] 反向引物；5 ' 一 CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3，
[0017] 探针；5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/B册 1-3，
[001引阻断核酸序列：
[0019] 5' 一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3' ；
[0020] (3)正向引物；5' 一CAGCGTGGCCAGCGTG-3，
[002U 正向引物；5 ' 一 TGATGGCCAGCGTGGACG- 3，
[0022] 正向引物；5，一TGATGGCCAGCGTGGACG-3，
[0023] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0024] 探针；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B册 1-3,；
[00巧](4)正向引物；5' 一GGAAGCCTACGTGATGGCCAT-3，
[0026] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0027] 探针；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B册 1-3,；
[0028] (5)正向引物；5' 一CTCCACCGTGCAGCTCATCAT-3，
[0029] 反向引物；5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC-3，
[0030] 探针；5，一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/B册 1-3,；
[0031] (6)正向引物；5' 一GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG-3，
[0032] 反向引物；5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG-3，
[0033] 探针；5，一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/B册 1-3,；
[0034] (7)正向引物；5' 一GATTTTGGGCTGGCCAAACA-3，
[00巧]反向引物；5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG-3，
[0036] 探针；5，一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/B册 1-3，。
[0037] 本发明的另一个目的是提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，其由上述引物和探 针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
[003引在本发明进一步地实施方案中，所述PCR混合反应液包括；双组分热启动DNA聚 合酶（化学修饰的化tStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶）、PCR Buffer、dNTPs、PCR增强剂、稳定剂、UNG酶等。
[0039] 本发明的另一个目的是一种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的 引物和探针，即化qman探针结合阻断核酸序列的real-time PCR技术，所述引物和探针为：
[0040] 正向引物；5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC-3，
[004U 反向引物；5 ' 一 CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3，
[0042] 探针；5，一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/B册 1-3，
[0043] 阻断核酸序列；5，一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3，。
[0044] 在本发明进一步地实施方案中，本发明还提供一种包含上述引物和探针的用于检 巧。EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的试剂盒，其由上述引物和探针、PCR混合反应 液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
[0045] 本发明利用一对通用引物对EGFR基因19号外显子缺失突变区域序列进行特异性 扩增，同时利用阻断核酸序列与待测样品中野生型DNA模板的特异结合，抑制该野生型DNA 模板与引物探针的结合，仅实现缺失突变的特异性扩增，从而达到一次检测反应可检出19 种缺失突变的一种或几种突变的效果。
[0046] 上述发明均可使各位点的检测灵敏度达到1%。
[0047] 本发明与现有的测序技术相比，具有下列优点：
[0048] (1)灵敏度更高，在20ng野生型人类基因组的背景下可W检出1%的微量突变模 板，减少了假阴性结果的出现。
[0049] (2)全封闭反应，无需PCR产物后处理，避免了 PCR产物的污染，减少了假阳性结果 的出现，且避免了 PCR反应液对操作员和环境的危害。
[0050] (3)检测速度快，从标本送检到出结果可在3个小时W内即可完成。
[0051] (4)结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。
[0化2] (5)操作简便，可控性强，可进行大批量样品的检测，有利于临床操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0化3] 图1本发明试剂盒对E746-A750del (2)突变型石蜡样本检测结果（突变检测管和 质控管FAM信号），突变检测管CT值23. 27,质控管CT值16. 78。
[0化4] 图2本发明试剂盒对E746-A750del (2)突变型石蜡样本检测结果（其余6管与质 控管FAM信号），其余6管CT值none,质控管CT值16. 78。
[0化5] 图3本发明试剂盒对E746-A750del (2)突变型石蜡样本检测结果（突变检测管 肥X信号（内控）），突变检测管肥X信号的CT值18. 13,其余6管肥X信号与此结果几乎一 致。
[0化6] 图4E746-A750del (2)突变型石蜡样本的测序验证结果。 具体实施方案
[0057] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，W下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 W解释本发明，并不用于限定本发明。
[0化引本发明共包含8个PCR反应，将EGFR的4个外显子的29种突变分为7管进行检 ，其中18号外显子的3种点突变在一管中检测，19号外显子的19种缺失突变在一管中检 巧Ij，20号外显子的3种插入突变在一管中检测，20号外显子的S768I和T790M各自一管进 行检测，21号外显子的L858R和L861Q各自一管进行检测。第8管为质控反应管。
[0化9] 本发明除19号外显子中含有一条阻滞核酸序列外，7个反应管中均包含PCR混合 反应液 SuperReal PreMix(Probe)，包括双组分热启动 DNA 聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、PCR 增强剂、稳定剂、UNG酶等，另外，特异性上下游引物、特异性化qMan探针、内控上下游引物， 内控^gMan探针等组分。
[0060] 实施例1本发明检测试剂盒的临床应用
[0061] 1、质粒标准品的构建；本发明构建了 EGFR基因29种突变型和野生型的质粒标准 品，作为阳性质控，并用于前期PCR体系的构建。
[006引 2、配制PCR反应体系；
[0063] 各反应管组分含量及终浓度如下：
[0064] 7支突变检测管； 「00 化 1
【权利要求】
1. 一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，其包含下列7组引物和探针中的任 意一组或多组，具体为： (1) 正向引物：5' 一CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC-3' 正向引物：5 ' 一CAAAAAGATCAAAGTGCTGA- 3 ' 正向引物：5 ' 一CAAAAAGATCAAAGTGCCGT- 3 ' 反向引物：5' 一ACAGCTTGCAAGGACTCTGG- 3' 探针：5' 一FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/BHQ1-3' ； (2) 正向引物：5' 一CACTGGGCAGCATGTGGC- 3' 反向引物：5 '一CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3 ' 探针：5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1-3' 阻断核酸序列： 5' 一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3' ； (3) 正向引物：5'一CAGCGTGGCCAGCGTG- 3' 正向引物：5 ' 一TGATGGCCAGCGTGGACG- 3 ' 正向引物：5 ' 一TGATGGCCAGCGTGGACG- 3 ' 反向引物：5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探针：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (4) 正向引物：5'一GGAAGCCTACGTGATGGCCAT- 3' 反向引物：5'一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探针：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (5) 正向引物：5' 一CTCCACCGTGCAGCTCATCAT- 3' 反向引物：5' 一AGGATCCTGGCTCCTTATCTC- 3' 探针：5' 一FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1-3' ； (6) 正向引物：5' 一GTCAAGATCACAGAmTGGGCG- 3' 反向引物：5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG- 3' 探针：5' 一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1-3' ； (7) 正向引物：5' 一GAmTGGGCTGGCCAAACA- 3' 反向引物：5' 一AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG- 3' 探针：5 ' 一FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1-3 '。
2. -种EGFR基因突变检测试剂盒，其由权利要求1所述的引物和探针、PCR混合反应 液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
3. 根据权利要求2所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述PCR混合反应 液包括：双组分热启动DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTPs、PCR增强剂、稳定剂、UNG酶。
4. 一种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的引物和探针，所述引物和探 针为： 正向引物：5 ' 一CACTGGGCAGCATGTGGC- 3 ' 反向引物：5 ' 一CAGCTGCCAGACATGAGAAA- 3 ' 探针：5' 一FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1-3' 阻断核酸序列：5'一CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-P04-3'。
5. -种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的试剂盒，其由权利要求4所 述的引物和探针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
【文档编号】C12Q1/68GK104513864SQ201510031716
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2015年1月21日 优先权日:2015年1月21日
【发明者】陈英, 孙秀莲, 王春苗, 孙利, 李欣 申请人:山东维真生物科技有限公司