一种基于岩藻聚糖酶与蛋白酶的海参复合酶解方法与流程

本发明涉及海参复合酶解技术领域，尤其涉及一种基于岩藻聚糖酶与蛋白酶的海参复合酶解方法。

背景技术：

海参是我国传统滋补食品，研究证实海参中含有岩藻聚糖、岩藻糖基化硫酸软骨素、胶原蛋白与皂苷等多种营养功效成分，具有增强免疫力、抗凝血、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗破骨细胞形成以及预防乙醇型胃溃疡等多种生理功能。随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，海参消费量近年来迅速增加。

海参酶解液是海参的主要深加工产品形式，海参经酶解，其功效成分从海参中释放至酶解液中以溶液状态存在，同时大分子物质被降解为小分子，易于人体吸收利用，相较泡发海参和即食海参，更适于老年人、儿童、病人等消化能力较弱的人群食用。海参酶解液经喷雾干燥后形成冲剂，也可调配至其他液体形式的食品中(如牛奶、饮料、酒等)增强其营养功能。当前，海参酶解液的制备主要通过单一或复合蛋白酶对海参进行水解。因蛋白占海参体壁干重的60-70％，因此蛋白酶被认为是海参酶解所必需的。然而，海参经蛋白酶酶解后，酶解液往往具有较高的粘度，严重影响着后续的澄清、脱色、超滤、浓缩及(或)杀菌等操作的效率与效果。

蛋白酶酶解后得到的酶解液其高粘度是由海参多糖引起的，尤其是海参岩藻聚糖。海参岩藻聚糖是海参中含有的一类由岩藻糖及硫酸基组成的多糖，约占海参干重的5-10％，其分子量超过1000kda，巨大的分子量导致其水溶液具有明显粘度。同时，海参岩藻聚糖具有抗肿瘤、抗胃溃疡、增强神经干细胞活力和增强免疫力等功能，据目前报道，海参是唯一含有的岩藻聚糖的大宗动物性食品原料，因此海参岩藻聚糖被认为是海参的特征性功效成分。如使用酸解、氧化降解、物理降解等方式进行海参岩藻聚糖的降解，虽能够使海参岩藻聚糖分子量下降从而降低粘度，但由于化学降解和物理降解规律性差、副反应多、多糖上的硫酸基等活性基团容易脱落，导致营养价值下降，甚至存在产生毒副作用未知的副产物的风险；上述降解还需要耐酸碱的特种容器或特殊设备，造成生产成本的增加。

岩藻聚糖酶是特异性水解岩藻聚糖的酶，该酶仅切割岩藻聚糖中的糖苷键，而不影响硫酸根等结构特征，而且岩藻聚糖酶降解岩藻聚糖还具有反应条件温和、易于控制、易于放大等优点。现阶段未见岩藻聚糖酶用于海参酶解的报道，且目前报道的内切-1,3-岩藻聚糖酶仅有两种，均为野生型岩藻聚糖酶，分别来源于wenyingzhuangiafucanilyticacz1127^t和专利菌种si-0098。野生酶需在岩藻聚糖底物的诱导下才可产内切-1,3-岩藻聚糖酶，酶的制备成本高、纯化难度大，且产酶总量低、活力低，难以在大规模生产中应用。本发明所用的克隆表达酶具有获取效率高、酶活力高和成本低等优点，适合在大规模生产中应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题为海参经蛋白酶酶解后，酶解液往往具有较高的粘度，严重影响着后续的澄清、脱色、超滤、浓缩及(或)杀菌等操作的效率与效果。

为解决上述问题，本发明提供一种基于岩藻聚糖酶与蛋白酶的海参复合酶解技术，在使用蛋白酶水解海参体壁蛋白质后，利用岩藻聚糖酶对海参岩藻聚糖进行降解，通过控制岩藻聚糖酶的添加量、酶解时间等条件达到降低海参岩藻聚糖分子量及酶解液粘度的目标。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：一种基于岩藻聚糖酶与蛋白酶的海参复合酶解方法，首先用蛋白酶水解海参体壁蛋白，然后向酶解液内加入岩藻糖酶进一步酶解，得到复合酶解液。其中，蛋白酶的作用是起到充分降解蛋白的效果；在蛋白降解的同时，海参岩藻聚糖从海参中释放并溶解于酶解液，其后利用岩藻聚糖酶内切岩藻聚糖，实现对溶液中岩藻聚糖的进一步分解，从而有效降低海参酶解液的粘度。

进一步的，所述岩藻聚糖酶为内切-1,3-岩藻聚糖酶，其氨基酸序列为seqidno.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。

seqidno.1：

mipnikklivlslvvlasscsttkthtntstivknekidfyvsdgskfisqdfypkfswestpeyamfgngaslltpkevekiaaktdficieknhayrtlefaeigareeiknfkaikpeikalyyfnsayawpftsynknfkknkiddypelkkfilvdkttgelqhrnntlcfdvlnpefrtwwvktvaqgvkdsgadgvfidqmhgfvwlrssqkeevekamgemmanlkaaigtnkillgnnassvkdvfpaidaamfehynnkklskenllkewgdmlanakagkmsifrigveaekeeasqtlikgsrgesleelskerleyyqacfligaqpysyfqygwgwrldtgplvdypelqkplgapkgaykrlhengweftrefehasvwvdtekkeakiewkk

所述内切-1,3-岩藻聚糖酶能够以内切方式降解多种来源的岩藻聚糖，可用克隆表达的方法制备，具有获取效率高、酶活力高和成本低等优点，适合在大规模生产中应用。

进一步的，编码上述内切-1,3-岩藻聚糖酶的基因所对应的核苷酸序列如seqidno.2所示；及可翻译出seqidno.1的所有基因。

seqidno.2：

atgattccaaatattaaaaagcttatcgttttatcattagttgtactggctagttcttgtagtacaacaaaaacacacaccaatacttcaacaatcgttaagaacgagaaaatagatttttatgtaagtgatggtagtaagttcatttcacaagatttttaccctaagttcagttgggaatccacaccagaatatgctatgtttggtaatggagctagcttattaactcctaaagaagttgaaaaaattgctgctaaaacagattttatttgtattgaaaaaaatcatgcttacagaactttagaatttgcagaaattggagctagagaagaaattaaaaactttaaagctataaagcctgagataaaagctttgtattactttaactcagcttatgcttggccttttacatcatataacaagaattttaagaaaaataaaatagatgattatccagagttgaagaaatttatattggtagataaaacgactggagaattacaacataggaacaatacactttgttttgatgtattaaaccctgagtttagaacttggtgggtaaaaacagtggcacaaggagtaaaagactctggtgctgatggagtttttatagatcaaatgcatggttttgtttggttacgtagttctcaaaaggaggaagttgaaaaagccatgggtgagatgatggcaaacttaaaagcagcaatagggacaaataaaatattattagggaataatgcctctagcgtaaaagatgtttttcctgcgattgatgcagctatgtttgaacattataataataaaaagttaagtaaagaaaaccttctgaaagaatggggagatatgttagcaaatgccaaagcaggtaaaatgtctatttttagaataggtgtggaagctgaaaaagaagaggcaagtcaaacattaataaaaggttcaagaggggaatctcttgaagaattgtctaaagagcgattagaatattaccaagcatgttttttaataggtgcgcagccttattcttacttccaatatggttgggggtggcgtttagatactggcccattggtagattatcctgaattacaaaaaccacttggagctccaaagggagcatataagcgtttacatgaaaacggttgggagtttactcgtgaatttgaacatgcttcggtttgggtagatactgaaaagaaagaagcgaaaattgaatggaaaaagtaa

进一步的，岩藻聚糖酶的添加量为1-1000u，反应温度为20～50℃，反应ph为7-9。在以上参数范围内，岩藻聚糖酶具有较高的酶解活力，能够保证酶解反应的快速进行，且酶的添加量与反应时间需相互对应，加酶量少则增加反应时间才能保证样品酶解彻底。超出此范围会降低酶解效率，增加生产成本。

进一步的，在蛋白酶酶解前，进行前处理：将新鲜海参匀浆或干海参磨粉，加入适量的水。

进一步的，得到复合酶解液后，可以根据最终产品形式及质量的需要，后续进行灭酶、澄清、脱色、脱腥、浓缩、超滤、喷雾干燥、调配等工序。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明描述了一种基于岩藻聚糖酶及蛋白酶的海参复合酶解技术，使用了岩藻聚糖酶，通过岩藻聚糖酶降解岩藻聚糖可有效降低酶解液粘度至2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)，粘度的降低将带来以下益处，能够显著提升海参酶解的工艺水平与相关产品品质：

①粘度降低有利于后续过滤处理，减少过滤次数和过滤介质使用，溶液易于澄清，增加产品的批处理量，降低生产成本；

②粘度降低可缩短酶解液离心时间及离心除杂效果；

③粘度降低便于脱色脱腥处理，可提高传质效率，缩短处理时间；

④粘度降低有利于浓缩中的传热传质，浓缩效率更高且避免局部焦糊，有利于高浓度浓缩液的制备，并进而有利于提高喷雾干燥的效率。

(2)高分子量的海参岩藻聚糖降解为低分子量多糖及(或)寡糖，有利于提升其营养功效。

(3)岩藻聚糖降解与蛋白降解可在一个容器内完成，无需添置新设备，易于生产工艺升级。

(4)利用岩藻聚糖酶的酶解反应条件可控、易于放大，可满足不同规模的生产。

附图说明

图1：岩藻聚糖酶的最适反应条件示意图；

图2：加岩藻聚糖酶后海参酶解液的黏度随时间变化示意图；

图3：加岩藻聚糖酶后海参酶解液中的岩藻聚糖分子量随时间变化示意图；

图4：加岩藻聚糖酶后海参酶解液中的岩藻聚糖分子量随粘度变化示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：岩藻聚糖酶的酶学性质

为获得岩藻聚糖酶的最适反应条件，分别从温度、ph等方面进行了探究。

1)最适反应温度及温度稳定性

利用大肠杆菌获得重组酶液，经适当稀释后与ph8.0、2mg/ml岩藻聚糖底物溶液混合，在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃下反应10min，灭活后使用还原糖增量检测法phbh法测定活力并计算比酶活，结果如图1a所示，其最适反应温度为40℃。将适量酶放置于4℃、25℃、30℃、40℃下0、1、2、4、6、16、24h后，取一定量的酶与底物溶液混合测定活力，以4℃放置0h时的活力为100％，结果以残余酶活表示(图1b)，结果表明此酶在4℃、25℃、30℃下至少可稳定放置至少1d(残余酶活>80％)。

2)反应ph及ph稳定性

利用大肠杆菌获得的重组酶液，取适量与不同ph值缓冲液(ph4.0、ph4.5、ph5.0、ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；ph6.5、ph7.0、ph7.5、ph8.0、ph8.5、ph9.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液；ph9.0、ph9.5、ph10.0、ph10.5、ph11.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)配制的2mg/ml岩藻聚糖底物溶液混合，使得反应处于不同的ph值环境下反应10min，灭活后使用phbh法测定活力并计算比酶活，结果如图1c所示，由图可知岩藻聚糖酶在ph6.5-10.5的条件下均有活力；其最适反应ph值为8.0。将适量酶放置于以上的ph值下1h，再将ph值调至8.0与底物混合进行酶活测定。以活力最高点的酶活记为100％，其他均以残余酶活表示(图1d)，结果表明此酶在ph6.5-10.0下均可保持稳定(酶活残余>80％)，说明此酶具有较宽的ph稳定范围。

实施例2：蛋白酶的酶学性质

为获得蛋白酶的最适反应条件，分别从胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶得温度和ph方面进行了探究。

1)胰蛋白酶

将胰蛋白酶作为酶解用酶对海参进行酶解，分别以时间、温度、ph值为可变因素，测得酶解的最佳条件为水解时间3h，温度55℃，ph为8.0。(刘程惠,董秀萍,赵露露,朱蓓薇.胰蛋白酶酶解法制备海参肽的工艺条件[j].大连轻工业学院学报,2006(02):83-85.)

2)木瓜蛋白酶

将木瓜蛋白酶作为酶解用酶对海参进行酶解，分别以温度、ph值为可变因素，测得酶解的最佳条件为温度60℃，ph为6.5。(梁杰,汪少芸.海参蛋白肽制备工艺优化及抗氧化性质[j].莆田学院学报,2016,23(02):67-71.)

3)中性蛋白酶

将中性蛋白酶作为酶解用酶对海参进行酶解，分别以温度、ph值为可变因素，测得酶解的最佳条件为温度50℃，ph为7。(梁杰,汪少芸.海参蛋白肽制备工艺优化及抗氧化性质[j].莆田学院学报,2016,23(02):67-71.)

4)碱性蛋白酶

将碱性蛋白酶作为酶解用酶对海参进行酶解，分别以温度、ph值为可变因素，测得酶解的最佳条件为温度50℃，ph为8。(梁杰,汪少芸.海参蛋白肽制备工艺优化及抗氧化性质[j].莆田学院学报,2016,23(02):67-71.)

以上蛋白酶的最适反应条件都与岩藻聚糖酶不同，所以不适合同时加入海参中酶解；另外，岩藻聚糖酶的酶解底物为岩藻聚糖，只有在蛋白酶分解后才能够得到大量的岩藻聚糖，才能够促使岩藻聚糖酶的反应，所以本发明采用两步法进行复合酶解，能够分别保证蛋白酶和岩藻聚糖酶的最适反应条件，从而提高反应速率、使反应更加彻底、节省成本、增加经济效益。

实施例3：海地瓜制备酶解液

1.将鲜活海地瓜去内脏、清洗，取处理后的海地瓜100kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在55℃，ph调为8，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的胰蛋白酶进行酶解处理3h；

3.将上述溶液温度降至30℃左右，调节ph为7，加入10u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解6h，得到粘度为5mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液。

实施例4：美国肉参制备酶解液

1.将美国肉参粉碎，取50kg肉参干粉加入1000l的发酵罐中，再加入800l左右的水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在60℃左右，ph调为6.5，加入匀浆肉糜质量分数2％的木瓜蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至35℃左右，调整ph为8后在酶解罐中加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解4h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液。

实施例5：梅花参制备酶解液

1.将鲜活梅花参去内脏、清洗，取处理后的梅花参100kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在50℃，ph调为7，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的中性蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为9，加入100u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解2h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液。

实施例6：刺参制备酶解液

1.将鲜活刺参去内脏、清洗，取处理后的刺参100kg切块匀浆成肉糜，装入800l的酶解罐中，加入500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在50℃，ph调为8，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的碱性蛋白酶进行酶解处理4h；

3.保持酶解罐中溶液温度不变，ph调为8，加入500u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解1h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

实施例7：制备海参营养口服液

1.将鲜活刺参去内脏、清洗，取处理后的刺参100kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在55℃，ph调为8，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的胰蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为8，加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解4h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

4.将所得酶解液在90℃的环境中加热15min进行灭酶处理；

5.灭酶后的酶解液进行离心处理，3000r/min离心15min，除去沉淀物；

6.在上述酶解液中加入10％的白砂糖，用柠檬酸调节ph值到5。

7.将上述酶解液加热至90℃，保持30min，冷却后3000r/min离心15min；

8.采用自动灌装机灌装并封口，将其放入杀菌釜，在0.20mpa、121℃条件下杀菌30min，得到海参营养口服液。

实施例8：制备海参酶解液压片

1.将鲜活海地瓜去内脏、清洗，取处理后的海地瓜500kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在60℃，ph调为6.5，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的木瓜蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为8，加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解2h，得到粘度为4mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

4.将所得酶解液在90℃的环境中加热15min进行灭酶处理；

5.灭酶后的酶解液进行离心处理，3000r/min离心15min，除去沉淀物；

6.在上述酶解液浓缩至20％，进喷雾干燥塔进行干燥，得到海参酶解液干粉；

7.将海参酶解液干粉过50目筛，后加入硬脂酸镁、蜂蜜粉和山梨糖醇搅拌均匀；

8.将上述混合干粉放入压片机，调节压片机参数，进行压片处理，得到片重为0.5g的酶解液压片。

实施例9：制备海参果汁复合饮料

1.将鲜活刺参去内脏、清洗，取处理后的刺参500kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在50℃，ph调为7，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的中性蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为8，加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解4h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

4.将所得酶解液在90℃的环境中加热15min进行灭酶处理；

5.灭酶后的酶解液进行离心处理，3000r/min离心15min，除去沉淀物；

6.将上述海参酶解液添加葡萄汁、柠檬汁以及西柚汁进行调配、均质，采用uht超高温瞬时灭菌，无菌罐装制成饮料成品。

实施例10：制备海参牛奶

1.将鲜活刺参去内脏、清洗，取处理后的刺参500kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在50℃，ph调为8，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的碱性蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为8，加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解4h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

4.将所得酶解液在90℃的环境中加热15min进行灭酶处理；

5.灭酶后的酶解液进行离心处理，3000r/min离心15min，除去沉淀物；

6.以生牛乳为基料，加热至70℃，再加入上述海参酶解液、柠檬汁以及稳定剂进行调配；

7.上述混合后的溶液保持65-70℃进行乳化均质，一段压力15-17mpa，二段压力1-3mpa；

8.采用uht超高温瞬时灭菌135℃，4s，灭菌冷却后无菌罐装制成海参牛奶。

实施例11：制备海参胶囊

1.将鲜活海地瓜去内脏、清洗，取处理后的海地瓜500kg切块匀浆成肉糜，装入2000l的酶解罐中，加入1500l水搅拌均匀；

2.将酶解罐中溶液温度保持在60℃，ph调为6.5，加入匀浆肉糜质量分数0.2％的木瓜蛋白酶进行酶解处理4h；

3.将上述溶液温度降至40℃左右，ph调为8，加入50u的岩藻聚糖酶，在保温状态下搅拌酶解4h，得到粘度为2mpa.s(旋转粘度计，转速30转/分)的海参酶解液；

4.将所得酶解液在90℃的环境中加热15min进行灭酶处理；

5.灭酶后的酶解液进行离心处理，3000r/min离心15min，除去沉淀物；

6.在上述酶解液浓缩至20％，进喷雾干燥塔进行干燥，得到海参酶解液干粉；

7.将海参酶解液干粉用钴-60灭菌，再在洁净室里用0号胶囊灌装，每瓶50粒，最后进行产品包装，得到海参胶囊。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制。本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种基于岩藻聚糖酶与蛋白酶的海参复合酶解方法

<130>中国海洋大学

<140>1

<141>2020-05-20

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>408

<212>prt

<213>wenyingzhuangiafucanilyticacz1127t

<400>1

metileproasnilelyslysleuilevalleuserleuvalvalleu

151015

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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