一种防治对虾急性肝胰腺坏死病的功能性饲料添加剂及其应用

本发明涉及饲料制备，具体的说是一种功能性饲料添加剂及其在防治对虾急性肝胰腺坏死病中的应用。

背景技术：

1、凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)又名南美白对虾，因其营养丰富、肉味鲜美、生长速度快、适盐度范围广等优点，已成为我国重要的水产养殖品种[1]。2020年我国凡纳滨对虾养殖总产量186.3万t，占对虾养殖总产量的86.54％[2]，但由于近年来高密度集约化养殖方式，细菌性疾病已对凡纳滨对虾的养殖生产造成严重危害，大规模凡纳滨对虾患病死亡，严重制约对虾养殖产业健康发展[3]。

2、急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，ahpnd)是目前凡纳滨对虾养殖中的主要细菌性疾病[4]，该病主要感染投放10-40d左右虾苗，又称早期死亡综合征(early mortality syndrome，ems)，患病凡纳滨对虾主要病症为虾体变软，肝胰腺萎缩、颜色发白，空胃空肠，摄食减少，死亡率高达90％以上[5]，已对中国、菲律宾、墨西哥[6-8]等多国对虾养殖业带来巨大的经济损失。研究表明，对虾急性肝胰腺坏死病是由携带了能编码毒力蛋白piravp和pirbvp质粒的部分弧菌引起的，其毒力蛋白可引起对虾肝胰腺上皮细胞脱落、坏死、肝胰腺功能障碍，进而导致对虾急性死亡[9]。已有报道显示，可引起对虾急性肝胰腺坏死病的病原菌包括副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)[10]、欧文氏弧菌(v.owensii)[11]、哈维氏弧菌(v.harveyi)[12]、坎氏弧菌(v.campbellii)[6]等。

3、脂肪酸结合蛋白(fatty-acid-binding protein,fabps)属于胞内脂质结合蛋白超家族成员，是一类低分子量的胞浆蛋白质，其分子中氨基酸数量介于126-137个，分子量在15kda左右[13]。fabps广泛存在于脊椎和无脊椎动物的组织细胞内，其可以特异性地结合细胞内疏水配基和游离氨基酸，负责胞内脂肪酸的转运和吸收，参与脂肪酸的代谢，调节基因的表达和细胞的生长[13]。fabps在巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞中不同程度的表达，表明其还可能参与机体的免疫过程[14,15]。

4、申请前期通过对凡纳滨对虾酵母双杂交cdna文库的筛选，鉴定了一种与vpahpnd毒素存在潜在相互作用的蛋白-脂肪酸结合蛋白(lvfabp)。研究表明注射lvfabp的dsrna可以显著降低vpahpnd攻毒的死亡率。但是dsrna在制备、保存和应用方面尚存在较大的难度，同时其作用机理是通过调控lvfabp基因的表达发挥作用。关于lvfabp蛋白本身是否能够阻断病害发生从而达到病害防控的效果，尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种功能性饲料添加剂及其在防治对虾急性肝胰腺坏死病中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种功能性饲料添加剂，添加剂为lvfabp的重组蛋白。

4、所述添加剂为seq id no:1所示lvfabp的重组蛋白，其添加量为10mg/kg。

5、功能性饲料添加剂的制备方法，以凡纳滨对虾为对象，克隆获得lvfabp全长编码序列，将lvfabp编码基因连接到pet-30(a)载体，并在工程菌e.coli bl21(de3)中进行异源高效表达，采用ni-nta层析柱对重组lvfabp进行蛋白纯化，得到重组对虾脂肪酸结合蛋白lvfabp。

6、所述获得lvfabp全长编码序列采用引物为：

7、上游引物f1:5′-atgggatccaaggctctgggtgttg-3′；

8、下游引物r1:5′-ccgctcgagtagtcccagtcatatcc-3′。

9、所述pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min。

10、所述lvfabp编码基因连接到pet-30(a)载体获得重组表达载体lvfabp+pet-30(a)，在将其转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，并在含iptg的体系内进行诱导表达，获得重组对虾脂肪酸结合蛋白lvfabp；所述含iptg的体系中iptg浓度为0.1mmol/l。

11、一种权利要求1所述的功能性饲料添加剂的应用，所述添加剂用于对虾急性肝胰腺坏死综合症的防治中的应用。

12、所述添加剂添加至对虾饲料(市售凡纳滨对虾配合饲料，蛋白含量≥39％)中，其添加量为10mg/kg。

13、本发明所具有的优点：

14、本发明解决现阶段dsrna在制备、保存和应用方面尚存在较大的难度，进一步对lvfabp的体外重组蛋白，添加到饲料当中后可有效延缓病害的发生并降低死亡率。体外重组表达的lvfabp在制备、保存和应用方面比dsrna具有更大的优势，可作为防治ahpnd的特异性功能性饲料添加剂，具有更加广阔的产业化应用前景。

技术特征：

1.一种功能性饲料添加剂，其特征在于：添加剂为lvfabp的重组蛋白。

2.按权利要求1所述的功能性饲料添加剂，其特征在于：添加剂为seq id no:1所示lvfabp的重组蛋白，其添加量为10mg/kg。

3.按权利要求1所述的功能性饲料添加剂的制备方法，其特征在于：以凡纳滨对虾为对象，克隆获得lvfabp全长编码序列，将lvfabp编码基因连接到pet-30(a)载体，并在工程菌e.coli bl21(de3)中进行异源高效表达，采用ni-nta层析柱对重组lvfabp进行蛋白纯化，得到重组对虾脂肪酸结合蛋白lvfabp。

4.按权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述获得lvfabp全长编码序列采用引物为：

5.按权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min。

6.按权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述lvfabp编码基因连接到pet-30(a)载体获得重组表达载体lvfabp+pet-30(a)，在将其转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，并在含iptg的体系内进行诱导表达，获得重组对虾脂肪酸结合蛋白lvfabp；所述含iptg的体系中iptg浓度为0.1mmol/l。

7.一种权利要求1所述的功能性饲料添加剂的应用，其特征在于：所述添加剂用于对虾急性肝胰腺坏死综合症的防治中的应用。

8.按权利要求7所述的功能性饲料添加剂的应用，其特征在于：所述添加剂添加至对虾饲料中，其添加量为10mg/kg。

技术总结
本发明涉及饲料制备，具体的说是一种功能性饲料添加剂及其在防治对虾急性肝胰腺坏死病中的应用。功能性饲料添加剂为LvFABP的重组蛋白。添加剂为SEQ ID NO:1所示LvFABP的重组蛋白，其添加量为10mg/kg。功能性饲料添加剂的制备方法，以凡纳滨对虾为对象，克隆获得LvFABP全长编码序列，将LvFABP编码基因连接到pET‑30(a)载体，并在工程菌E.coli BL21(DE3)中进行异源高效表达，采用Ni‑NTA层析柱对重组LvFABP进行蛋白纯化，得到重组对虾脂肪酸结合蛋白LvFABP。LvFABP的体外重组蛋白，添加到饲料当中后可有效延缓病害的发生并降低死亡率。体外重组表达的LvFABP在制备、保存和应用方面比dsRNA具有更大的优势，可作为防治AHPND的特异性功能性饲料添加剂，具有更加广阔的产业化应用前景。

技术研发人员：谷晓倩,刘梅,王雷,王宝杰,蒋克勇
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12