专利名称：转移基因的动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及畜牧业，具体地说是涉及产生具有预期特性之新的动物品种的方法，这些预期特性包括增加体重、饲养效率、牛奶产量或对疾病的抵抗力等。
使用传统饲养方法，有可能得到具有特定预期特性的动物。但在得到这些预期特性的同时，也常常产生许多不需要的特性。
近年来已发展了将外源基因引入动物基因系中的方法。一般说来，这是使用RNA/DNA技术(其包括分离和定性基因)和单细胞胚胎技术(其包括收集和再植入卵子)完成的。整个方法大致包括以下步骤-分离纯的基因样品(DNA片段);
-收集新近受精的卵;
-将极小部分(如10-9立方厘米)的基因溶液注入雄性细胞核(来自精子者)内，然后使之与雌性细胞核融合，以形成单细胞胚胎;以及-将已接受了上述注射的卵子植入适当选择的代孕母体内。
子代出生后，取其小部分组织(通常是尾部组织)，制备DNA并分析之，以确定单一细胞阶段注入的基因是否已稳定地掺入动物染色体内。如果是这样，即证明发生了基因转移。
上述方法已被成功地用于通过引入包含外源基因(如人生长激素基因)的构建物，来加速小鼠生长并增加动物大小。然而，该方法尚未在改善家畜之预期特性方面取得成功。
本发明的一个目的是克服或至少减少现有方法中存在的一个或多个困难和/或缺陷。
根据本发明的一个方面，提供了一种创造动物新品种的方法，其包括(a)得到新近受精的卵;
(b)分离与卵细胞同源之特征化激素的基因样品;
(c)将基因样品引入卵的雄性核内，然后与雌性核融合以形成单细胞胚胎;以及(d)将卵植入适当制备的雌性动物体内。
新近受精的卵可以是任何动物的受精卵。适当的动物包括家畜如马、乳牛、猪和羊。可按已知方法制得受精卵。
与卵同源的特征化激素的基因样品必将取决于所得到的动物卵。例如，如果动物卵是得自猪的，则基因样品将包含特征化的猪激素。
被分离和注射的特征化激素的类型可以是任何预期特征性激素。被分离和注射的激素的类型可以依据预期的子代的特性而定。例如，如果子代是猪，而且预期的特性是加速生长，则基因样品可包含猪生长激素。可依照已知方法分离基因样品。
依据本发明的另一个方面，其提供一个质粒表达载体，该质粒包含编码一非猪启动子区之DNA的第一克隆序列和编码猪生长激素(PGH)活性之DNA的第二克隆序列。
如此形成的质粒表达载体可在编码区内包含一猪生长激素的完整拷贝。
可使用任何适宜的质粒表达载体或克隆载体，例如质粒克隆载体pUC19(Nonander等，Gene，26101-106，1983)。
DNA的第一克隆序列可编码人启动子区。人启动子区可以是人金属硫因启动子(hMTIIA)。在一优选方案中，可使用经修饰的金属硫因启动子质粒。DNA的第一克隆序列可在质粒克隆载体中形成-EcoRⅠ-HindⅢ插入片段。该插入片段长约810-823bp。在一优选实施方案中，其长度为823bp。DNA的第一克隆序列也可含有人金属硫因启动子的元件。
可由信使或聚腺苷化RNA形成的cDNA库中分离编码猪生长激素的DNA序列。例如可由猪脑垂体组织中分离。
DNA的第二克隆序列可在质粒表达载体中形成-EcoRⅠ-EcoRⅠ插入片段。该插入片段长约522bp。质粒为一小的、有高拷贝数的表达载体。质粒表达载体可以是质粒pUC19或pKT52。
本发明的质粒可进一步包括一个DNA的第三序列。第三克隆序列可包含猪生长激素基因的3′末端。第三克隆片段可在DNA的第二克隆片段中形成一SmaBam/Sma插入片段。该插入片段长约1000bp。
3′末端片段也可以是被修饰了的。在一实施方案中，缺失了某些被鉴定为重复序列的区域。例如，相对于约1000bp的原始序列，在缺失了重复序列后可留下约200碱基对的3′片段。修饰猪生长激素DNA样品的3′端以除去重复序列，是稳定猪基因组中转移基因之染色体排布的一个附加因素。亦可在猪基因编码区内括入内含子来实现这一稳定化作用。
业已发现，3′端片段至编码区的包涵物可利于增加自基因转录之解读序列(信使RNA或mRNA)的稳定性。
具上述类型的一个特定质粒是定名为pHMPG.4的质粒，该质粒的样品保存在Adelaide大学(澳大利亚)的培养物保藏中心内。根据本发明的一个优选方案，其提供了质粒pHMPG·4。图1中显示了pHMPG·4构建物的基因图。
本发明另一个方面提供了制备上述质粒表达载体的方法，其包括-提供一适当的质粒克隆载体、含非猪启动子的第一DNA片段，以及编码猪生长激素的第二DNA片段;
-将第一DNA片段在一适当位点处插入到质粒克隆载体中;以及-将第二DNA片段在一适当位点处插入到质粒克隆载体中。
该方法还进一步包括-提供第三个DNA克隆片段，其包括了得自猪生长激素基因之染色体拷贝的猪生长激素基因的3′末端。
可通过在猪生长激素DNA的限制性切点上切断已经作过限制性分析的质粒表达载体，并将第三个DNA片段在适当位点克隆到第二片段中。
图2中总结了这些步骤。
应了解到的是，制备所述质粒的方法将包括定性猪生长激素之编码区和相关非编码区的预备步骤。猪生长激素的这一特征将在下文述及。图1中显示了PGH基因组基因的核苷酸序列。
可使用适当方法，将质粒或基因如猪生长激素基因的样品，即得自图1所示质粒的HindⅢ/PvuⅠ片段引入到猪卵的雄性前核中。亦可将基因样品注射到卵的雄性前核内。
本发明的一个优选方面提供了一种得到转移基因之动物的方法，其包括(a)提供雌性动物的新近受精的卵子;
(b)制备含启动子和将被表达基因之克隆区第一和第二克隆片段的质粒表达载体，以及(c)将质粒注入雄性前核内，然后使其与雌性核融合，以形成单细胞胚胎。
将基因构建物注入雄性前核内时所遇到的一个主要问题是不易看到卵细胞内的前核或核。有些动物如兔的核结构很容易看到，但有些动物如羊和猪的前核和核却很难定位。
可使用DNA特异性荧光染色体，借助荧光显微镜检法或干涉反差(IC)显微镜检法看到羊卵细胞的前核和核。染色和使用紫外光有可能损伤卵细胞。因此最好使用干涉反差显微镜检法进行羊卵细胞内的微量注射。荧光分析证明，干涉反差显微镜法是在大约80%羊卵细胞中进行前核定位的一种有效方法。可用相似方法显现山羊卵的前核和核。
猪卵是不透明的，即使使用干涉反差显微镜也看不到核结构。但如果将天然猪卵于15000g离心3分钟，则可能看到猪卵的前核和核。用相似方法也可以看到乳牛卵的核。但使用离心法却无助于显现绵羊卵细胞的前核。
可于放大下并使用标准的微量注射装置注射前核。可用平头抓特移液管吸住卵细胞并用注射移液管穿刺透明带、胎浆膜和前核被膜。注射移液管的直径约为1.5μm，而平头抓持移液管的直径约为50μm。
被注入的基因构建物的量将取决于前核的大小和注射移液管的大小。例如，可以注射数百个含预期基因之2.6kb线性片段的拷贝。
然后可用任何适当方法将卵植入任何适当制备的代孕母体内。该过程可用任何已知方法来完成。
下列非限定的实施例将进一步阐明本发明。
实施例1PGHcDNA序列用合成的DNA探针自使用质粒载体pUC19(Norrander等，Gene，26，101-106，1983)构建的含大约4000个重组体的猪脑垂体cDNA库中分离PGHcDNA克隆。所分离出的cDNA克隆中有一个(即pPG·3)经测定完整序列，发现含有预计长度的插入片段。
发现pPG·3cDNA插入片段的开放读码可编码含216个氨基酸的激素原，而后者的氨基酸序列与Seeburg等人(DNA，2，37-45，1983)所述PGH cDNA克隆之部分长度所编码码的氨基酸序列完全相同。该克隆第一次提供了PGH信号序列编码区的完整序列以及5′非翻译区的41个碱基序列。
编码区内的核苷酸序列是十分保守的，与Seeburg等人(1983)所报导的序列只有一个碱基差异。
图3PGH基因组基因的核苷酸序列图中显示了全部2231bp序列。其中指出了编码PGH原(前PGH)的开放读码，这些碱基不同于先前研究的PGH cDNA序列pPG·3的碱基序列。用星号标示了导致氨基酸取代的碱基改变。也在序列下方标出了不同于pPG·3的3′非翻译区中的信号碱基。根据大鼠和人GH基因帽位点的位置(Page等，1981;DeNoto等，1981)推断出了其帽位点(+1)的定位。
下面划线的是推测的启动子和聚腺苷酸化序列如TATA、AATAAA和富含GT序列，并用箭头指出了加入PolyA尾部的位置。变异的GC供体剪接位点位于第一个内含子中，大约在碱基+72处。
图中指出了进行下面几节中所述再克隆的SmaⅠ限制性位点。
用PGHcDNA杂交探针进行Southern分析当用pPG·3的cDNA插入片段探查已用三个不用的限制性酶切割过的猪基因组DNA的Southern印迹时，每一泳道中均检测到一个强杂交的带。限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ也产生了第二个较弱的带，此表明如果基因在事实上是作为单一拷贝存在的，则基因组基因必然含有这些酶的内在切点，并接近同源于cDNA之区域的末端(后来发现这一推测是正确的)。使用第三个酶即HindⅢ则只产生了一条清晰的带。综合这些资料，即可证明猪基因组(每个半倍体染色体互补体)中只存在一个GH基因的拷贝相对于以前测定了序列的PGHcDNA克隆即pPG·3，该基因编码区内包含4个碱基改变，这种情况与牛和大鼠基因组相似，而与人则完全不同。
分离和分析基因组PGH基因使用PGH cDNA克隆pPG·3筛选猪装配型质粒库并分离含有PGH基因序列(2.4)的克隆。对装配型克隆的Southern分析鉴定出了主要的Bam HⅠ和Eco RⅠ杂交带，其大小与利用同一杂交探查所作基因组Southern分析中测得者相同。对包含于装配型质粒内的基因作核苷酸序列分析显示其包含整个编码区(648bp)、178bp启动子区、61bp5′非翻译序列、分别为242、210、197和278bp的四个内含子以及414bp3-1非编码序列(图3)。相对于以前测定了序列的PGHcDNA克隆即pPG·3，该基因编码区内包含4个碱基改变，如图3中所示的碱基取代导致了信号肽内两个氨基酸残基的改变。其余两处差异则没有取代。与pPG·3cDNA序列相关的3′非翻译区内也有一个碱基改变(图3)。
图4中所示的序列比较表明，被研究之各序列的启动子具有高度同源性。图3表明，GH和HPL基因的5′非翻译区也是极为保守的。
对PGH基因3′序列的分析，可以鉴定出那些已显示在聚腺苷酸化过程中是很重要的序列。
将PGH基因的3′序列与所有可得到的GH和HPL序列相比较，已显示GH和HPL基因之间也保守到一个令人惊异的程度。
图4GH和HPL基因启动子及5′非翻译序列的比较将猪(P)、牛(B)、人(H)和大鼠(R)GH基因以及人胎盘催乳激素(HPL)基因成直线平行排列，以测定序列同源性程度(2、5、3)。相邻序列间的同源碱基以星号标示。PGH序列的编号是由帽位点(+1)计起的。
这一例子说明包含于pPG·3中的猪GHcDNA插入片段已克隆到细菌表达载体中。
PGH在大肠杆菌内的表达为在大肠杆菌中生产PGH，所选用的表达载体为pKT52。这一由J.Shine(California Biotechnology)提供的质粒是一小的、有高拷贝数的表达载体，其含有能力很强的并且可以调节的trc启动子(Brosius等，1985)和作用很强的大肠杆菌5S转录终止区(Brosius等，1981)。trc启动子是一含有大肠杆菌trp启动子之相符-35区直到大肠杆菌lac UV5启动子之相符-10区的融合启动子(de Boer等，1983a)。该启动子的lac UV5序列含有-lac操纵子位点，从而致使由该启动子发起的转录过程在lacⅠq菌株中受到抑制。如在IPTG存在下培养细胞，则可刺激在lacⅠq菌株中由该启动子发动的转录过程(de Boer等，1983a)。图5中显示了pKT52之RBS/克隆区的限制性酶切图及序列。
图5PGHcDNA克隆到表达载体PKT52中本图说明了大肠杆菌表达载体pKT52的组织。自含有pPG，3之EcoRⅠ插入片段的M13RF中分离一800bp PstⅠ片段。该片段含有整个PGH原编码区，减去前两个氨基酸，加上33bpmP19多聚连接子DNA。如将该片段插入PKT52的PstⅠ位点，即可再生整个PGH原序列(3.2.1)。然后分离PKT52的EcoRⅠ插入片段并克隆到M13mp19中，以促成pKT52/PGHcDNA接合点的诱变(3.2.2)。图中指出了trc启动子和rRNA转录终止区的位置(rrnT1和rrnT2)。
使用两个大肠杆菌菌株即菌株MC1061和JM101来分析该实施例中所述有效表达的水平。由trc启动子开始的表达可在MC1061细胞中正常进行，但在lacⅠq菌株(JM101)中则受到抑制。如在含有1mM IPTG的条件下培养细胞，却可解除在JM101细胞中出现的对由trc启动子开始之转录过程的抑制。
质粒pGHX.1使用寡核苷酸定点突变法，删除编码激素原之氨基酸2-26的DNA，以构建表达蛋氨酰基-PGH(m-PGH)的构建物。该缺失部分是连接到直接与ATG起始密码子之成熟PGH分子的第一个氨基酸的TTc密码子上的。
分离含有与trc启动子序列融合之完整PGHcDNA的pKTGH的EcoRⅠ插入片段并克隆到M13mp19中。自该噬菌体中分离单股DNA，然后用于诱变反应。为了去除编码激素原之氨基酸2-26的75个碱基，而将一与所需删除之每侧15个碱基的30碱基长的寡核苷酸GH·30用于诱变反应。退火并伸展之后，将诱变反应混合物转化到JM101中。然后筛选噬斑，通过对从转化平板摘取的两份样品的噬斑杂交来检测是否产生了所需缺失。结果发现被筛选的150个噬斑中，有35%在双份平行实验中与GH·30寡核苷酸探针杂交。自许多阳性噬斑中分离单股DNA并使用PGH特异性寡核苷酸GH·25作引物，测定其序列以进一步确定此缺失的准确性。所有阳性噬斑均含有已产生正确缺失的DNA。由该已缺失的噬斑(mpGHX·1)中分离复制型(RF)DNA，纯化EcoRⅠ插入片段并再克隆到pKTGH的较大EcoRⅠ片段中，以产生质粒pGHX·1。图6中显示了该质粒和已述及的其他表达质粒之5′末端的核苷酸序列。
图6PGH表达质粒之5′区的核苷酸序列图解显示了mRNA前导物之最后24个碱基以及第3节中所述各表达质粒编码区之5′端的核苷酸序列。使每个序列都与PGH特异性寡核苷酸GH·25进行引导的序列分析反应，以测定其各自的核苷酸序列(图5;6、2、5)。除pKTGH(PGH原)和pGHXF(PGH融合蛋白)的表达载体外，每个质粒均编码蛋氨酰基PGH(m-PGH)。m-PGH表达质粒的碱基中不同于pGHX·1序列者已在下面加横线标出。
pGHXS(间隔区)质粒用具有一个重复的38碱基寡核苷酸(GH·38)将RBS中的AGGAAA改变为AGGAGG，并将间隔DNA由CAGACC改变为TAATAT或TAAAAT。对含有pGHX·1之小EcoRⅠ片段的单链DNA作诱变处理，然后选择阳性噬斑并测定序列。共有30%的噬斑与GH·38探针杂交，但其中只有20%含有GGTAATAT或GGTAAAAT RBS/间隔序列。其余阳性噬斑含有重复插入，这种现象可能是由于诱变反应期间GH·38寡核苷酸的不正确杂交所引起的。由含有两个所需改变之正确变体的噬斑中分离RF DNA，然后克隆回pKTGH中，图4中图解显示了所得质粒pGHXS·4和pGHXS·9之RBS/间隔区的核苷酸序列。结果发现由含有这个质粒的MC1061和经诱导的JM101细胞中制备的提取物均含有另一个主带，其分子量为22K并具有m-PGH的预期大小。对SDS/PAGE凝胶所作激光光密度测定表明，两种质粒产生了相同水平的m-PGH，其在两宿主内的量为细胞总蛋白的15～20%。
图7图解显示了在未诱导的和诱导的JM101细胞内由pGHXS·4产生的m-PGH的水平。图中还显示了由大肠杆菌产生的蛋白质与垂体中制得的PGH在分子量上的相似性。m-PGH移动距离显示其分子量稍高于预计的分子量(约200道尔顿)，这可能是由于加到凝胶上的蛋白质提取物极其不纯。以前对含有人GH的粗制细胞提取物所作分析中也观察到了这一现象(Hsiung等，1986)。
图7由质粒pGHXS·4产生m-PGH将得自含表达质粒pGHXS·4之未诱导(-IPTG)和诱导的(+IPTG)JM101细胞的蛋白质提取物，连同分子量标记物及自脑垂体制取并纯化的PGH(由R.Seamark提供)一起作SDS/PAGE分析。结果表明只在IPTG诱导的细胞内3·2·2，ⅲ产生了有预计分子量(22，000道尔顿)之PGH的优势带。
人MT-IIA启动子/PGH融合基因的构建为进行这些研究，选用了由R.Richards提供的人金属硫因Ⅱ-A启动子(Karin和Richards，1982)。
将hMT-ⅡA启动子作为一个823bp片段(其中启动子序列由-763延伸到+60位)克隆到M13载体mp8(A·Robbins个人交流)中。用HindⅢ和EcoRⅠ双重酶切含有该启动子的RF噬菌体，以释放出与5bp载体多聚连接子序列融合的启动子序列。纯化该823bp片段并再克隆到HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pUC19中，以产生质粒pUCMT。
自PGHcDNA克隆pPG·3中分离作为814bp EcoRⅠ片段之编码PGH的序列。经用EcoRⅠ限制性切断pUCMT，然后连接到纯化的pPG·3插入片段上，从而将上述序列克隆到hMT-ⅡA启动子的下游。对由所得转化体制备的质粒DNA作限制性分析(6.3.4.ⅱ)，鉴定出一个含有的正确定向插入之PGHcDNA的质粒，并定名为pUCMTGH·4(图6)。通过将跨越这个区域的限制性片段定向克隆到M13mp18中，测定这两个片段之间接合点的核苷酸序列。由该克隆得到的序列资料表明已产生了预期的序列，并已包含了通过9bp多聚连接子/合成连接子DNA连接到PGH5′非翻译区(从+21位起)上的hMT-ⅡA启动子序列和转录起始位点(向下达到+60位)(图8)。
决定将得自质粒pGHB·3(cPGH·1的2Kb BamHⅠ亚克隆)的1Kb SmaⅠ/BamHⅠ片段(其含有SmaⅠ位点之下游的第五外显子加上pgh基因的长约800bp的3′非翻译序列)再克隆到pUCMTGH·4的唯一的SmaⅠ位点中。
纯化pGHB·3的1Kb SmaⅠ/BamHⅠ片段(6、3、2。ⅱ)并用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修复BamHⅠ酶切产生的单股突出部分。然后将该平头片段再克隆到SmaⅠ酶切的pUCMTGH·4中。检查自大量所得转化体中分离的质粒DNA，发现其大多数大小都相当于pUCMTGH·4。使用得自pGHB·3之远3′端的500bpBamHⅠ/PstⅠ限制片段作为杂交探针，经滤膜杂交来筛选其中存在cPGH·1序列的转化体。对由所得阳性菌落制得的质粒DNA作限制性分析，表明有一个质粒含有以正确定向插入的片段。将该质粒定名为pHMPH·4(HM人金属硫因;PG猪生长激素)。图1中图解显示了该质粒的组织情况。
图2真核生物表达质粒pHMPG·4的构建图中给出了构建pHMPG·4的流程。将含有hMT-ⅡA启动子的约800bpHindⅢ/EcoRⅠ片段克隆到经HindⅢ/EcoRⅠ酶切的、脱磷酸的pUC19中以产生质粒pUCMT。然后用EcoRⅠ限制性切断该质粒、脱去磷酸、并连接到PGHcDNA克隆(pPG·3)的EcoRⅠ插入片段上，以产生质粒pUCMTGH·4。用SmaⅠ限制性切断该质粒，脱去磷酸并连接到装配型质粒亚克隆pGHB·3的平头1kbSmaⅠ/BamHⅠ插入片段(其含有PGH基因组基因之最后外显子的大部分及长约700bp的PGH3′非编码序列)上，以产生pHMG4。所有这些构建物均经序列分析进行了检定。
图8pUCMTGH·4中hMT-ⅡA/PGH接合点的核苷酸序列自pUCMTGH·4中分离跨越hMT-ⅡA和PGHcDNA序列之间接合区的SmaⅠ/PstⅠ片段，并克隆到SmaⅠ/PstⅠ酶切的mp18中进行序列分析。由该克隆所得序列资料表明已产生了正确的融合，其中hMT-ⅡA启动子、帽位点(有两个帽位点，均标示为+1)和5′非翻译序列(向下延伸至+60位)已通过9bp之合成连接子序列连接到了由碱基+21向下游延伸的PGHcDNA序列上(4.2)。
图1表达载体pHMPG·4图解显示了表达载体pHMPG·4的限制性酶切图及组织。使hMT-ⅡA启动子序列与含有自+21位向下延伸至唯一SmaⅠ位点之PGH cDNA序列的杂合基因相融合(后者连接到该接合点下游的PGH基因组基因序列上)。用低融点凝胶作电泳纯化含有整个启动子和PGH序列的2.7kb HindⅢ/PvuI片段加上连接到3′端的120bpPUC19Lac Z基因，并用于诱变产生转移基因的动物。
产生转移基因的猪用pHMPG·4的HindⅢ/PvuⅠ片段来产生转移基因的猪。从超数排卵的大白母猪体内收集体内受精的单细胞猪胚胎。制备这些胚胎并注入大约600个pHMPG·4插入片段的拷贝。以外科手术方法将经过注射的30个胚胎植入多个同时接受这一实验之母猪的输卵管内。其中四只母猪生下了成窝仔猪(每窝4-5只)，总共生出17只小猪。
对转移基因的猪的分析ⅰ)点印迹实验通过对分离自尾部组织的DNA的点印迹杂交来检验小猪体内是否存在外来基因。这些点印迹包括分别作为阴性和阳性对照的正常猪DNA和人基因组DNA。这些点印迹与hMT-ⅡA启动子的HindⅢ/AvaⅠ片段杂交后，显现了许多阳性信号。其中四只猪显示相当于每个细胞有一个以上拷贝的强杂交，另外有两只猪显示微弱的杂交(稍高于本底)，并相当于每个细胞有不足一个拷贝(图9)ⅱ)条形印迹(Slot-blots)实验通过长条形印迹分析法检测存在于每只经转移基因的猪体内每个细胞中pHMPG·4插入片段的拷贝数。将得自每只转移基因动物之尾组织DNA的5μg样品，连同人和猪的阳性和阴性对照物转移到长条印迹上。亦包括相当于每个细胞1至40个拷贝之基因组拷贝数的pHMPG·4质粒DNA的剂量范围(其还含有5μg对照猪基因组DNA)。该长条形印迹与hMT-ⅡA启动子的制品翻译的HindⅢ/AvaⅠ片段杂交，然后在高严紧条件下洗涤之。以激光光密度法将转移基因之动物DNA的杂交强度与质粒标准品进行比较，发现其范围为从375号和739号动物的每个细胞约0.5个拷贝到295号动物的每个细胞15个拷贝(表1;图9)。
ⅲ)Southern分析用Southern印迹法研究转移基因的猪DNA内外来序列的组织。pHMPG·4插入片段内没有BamHⅠ位点。因此用该酶切割转移基因动物的基因组DNA应在基因组Southern印迹上产生不同的带，这些带的长度则是由最近的BamHⅠ位点至整合位点的距离、整合位点的数目以及已整合之pHMPG·4插入片段的拷贝数决定的。
图9用点印迹法分析可能已转移了基因的猪自注入了pHMPG·4之插入片段的卵发育成的猪的尾组织中分离10、5和1μgDNA样品，使之变性并加到一薄膜上。每排点印迹中均包括pHMPG·4和人(HUM)基因组DNA阳性对照及猪(PIG)基因组DNA阴性对照。质粒阳性对照是第1排的印迹A。这一排中括号内的数目是指与各质粒点印迹相当的每个细胞内的拷贝数。A4至A11及B1至B9等排中的样品均含有试验样品。将该缺口翻译的hMT-ⅡA启动子HindⅢ/AvaⅠ插入片段用作杂交探针。下面图9的说明显示了各点印迹上样品的一致性。
A.
1234567891011A.10μg(2)HUM PIG 177 178 179 180 295 296 297 298B.5μg(1) HUMPIG177178179180295296 297 298
C.1μg(0.5) HUMPIG177178179180295296 297 298B.
1234567891011A.10μg373374375376735736737738739 PIG HUMB.5μg(1) 374375376735736737738739 PIG HUMC.1μg (0.5)374375376735736737738739 PIG HUM图10对转移基因猪的条形印迹分析将转移基因的猪DNA以及猪和人的阴性和阳性对照样品作变性处理后，与含各种不同量pHMPG·4质粒DNA(这些质粒DNA均结合了5μg猪对照DNA)的许多样品一同加到滤膜上。所加pHMPG·4DNA的量相当于每个细胞有1至40个基因拷贝的基因拷贝数(如下表括号内所示)。所用的探针是缺口翻译的hMT-ⅡA启动子HindⅢ/AvaⅠ插入片段。下面给出了对印迹上样品的
。使用激光光密度计对该膜上各个样品的杂杂强度进行定量分析。下表中给出了这一分析的结果。
ABC117718029523757367393PIGHUM45500(40)125(10)50(4)6375(30)100(8)25(2)7250(20)75(6)12.5(1)
表1转移基因猪基因拷贝数、生长情况及血清PGH浓度图中显示了用条形印迹分析法来估计存在于各转移基因猪细胞内外来基因的拷贝数(每个细胞的)，同时给出每天测得的猪体重(测50至120天)及转移基因猪与同窝内未转移基因猪的血清PGH浓度。雌性对照组是三只猪的均值，雄性对照组是两只猪的均值。
猪序号性别拷贝数/细胞每天体重增加血清PGH浓度(gm)(ng/ml)177F376510.4295F1595327.8739F0.56866.9对照组F-80610.6180M685115.3375M0.54876.3736M685711.1对照组M-67015.3图11转移基因猪的生长速率将各转移基因猪的生长情况对同窝未转移基因猪的生长速率作图。点线代表同窝未转移基因的性匹配猪的平均生长速率，破拆线代表异性未转移基因同窝对照猪的平均生长速率。实线则代表转移基因之动物的平均生长速率。
实施例2去掉Spl结合位点的hMT-ⅡA/PGH质粒pHMGPG·3
据报导，位于邻近基本序列处的相符Spl结合位点序列GGGCGG(Kadonaga等，TrendsBiochem.Sci，11，20-23，1986)可产生具有所需参数的启动子。M.Karin提供了一个改变了的hMT-ⅡA启动子的核苷酸序列，该序列的Spl结合位点已被PstⅠ连接子所取代，并具有所需的转录特性。这种改变是在hMT-ⅡA/mp8克隆中经过寡核苷酸定点诱变而产生的。
选用一46碱基长的寡核苷酸MT.46来取代围绕并包括Spl结合位点的15bp区连同-17碱基长的PstⅠ连接子序列。用MT·46诱变hMT-ⅡA/mp8单股DNA并转化到含有正确序列取代的JM101噬斑中，然后经噬斑杂交法和核苷酸序列测定法选择这些噬斑。自包含正确突变的一个噬斑中分离RF DNA，纯化HindⅢ/EcoRⅠ插入片段并用以与pHMPG·4的EcoRⅠ插入物及HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pUC19DNA进行三片段连接。由此连接所得到的一个质粒具有正确的限制性酶切图，将其定名为pHMGPG·3(无GC序列)。
现已将该质粒的插入片段引入转移基因的小鼠体内。
可以设想，本发明的方法亦可用于生产包含与见于小鼠、羊或人金属硫因启动子中的序列相对应的不同反应性元件之结合形式的合成启动子构建物，而其中可以有或没有其他启动子元件。例如其可用于调节Fe++水平。
最后，应明确的是，在不违背本说明书所述的本发明之发明构思的前提下，尚可对有关内容作各种其他修饰和/或改变。
权利要求
1.一种制造动物新品种的方法，其包括(a)获得新近的受精卵；(b)分离与卵同源的特征化激素的基因样品；(c)将基因样品引入卵的雄性核内，然后使之与雌性核融合以形成单细胞胚胎；以及(d)再将卵植入适当制备的雌性动物体内。
2.根据权利要求1的方法，其中动物是选自马、乳牛、猪和羊。
3.根据权利要求2的方法，其中动物是猪，且特征化的激素是猪生长激素。
4.一种包含质粒克隆载体的质粒表达载体，其包括编码非猪启动子区之DNA的第一克隆序列以及编码猪生长激素活性的第二克隆序列。
5.根据权利要求4的质粒表达载体，其中质粒克隆载体选自于pUC19或pKT52。
6.根据权利要求4或5的质粒表达载体，其中DNA的第一克隆序列编码人金属硫因启动子(hMTⅡA)。
7.根据权利要求4至6中任何一项的质粒表达载体，其中DNA的第一克隆序列在质粒克隆载体中形成-EcoRⅠ-HindⅢ插入部分，且其长度约为810-823bp。
8.根据权利要求4至7中任何一项的质粒表达载体，其中第二克隆序列在质粒克隆载体中形成-EcoRⅠ-EcoRⅠ插入部分，且其长度约为522bp。
9.根据权利要求4至8中任何一项的质粒表达载体，其包括了插入到第二克隆序列中的DNA的第三克隆序列。
10.根据权利要求9的质粒表达载体，其中第三克隆序列包括猪生长激素基因的3′末端。
11.根据权利要求9的质粒表达载体，其中第三克隆序列在长约1000bp的第二克隆序列中形成-SmaBam/Sma插入部分。
12.根据权利要求9或10的质粒表达载体，其中3′末端是经过缺失鉴定为重复序列的区域而被修饰了的。
13.根据权利要求4的质粒表达载体包括pHMPG·4。
14.一种制备如权利要求4至13中任何一项所限定之质粒表达载体的方法，其包括-提供适当的质粒克隆载体、含非猪启动子之DNA的第一片段、以及编码猪生长激素之DNA的第二片段。-将DNA的第一片段在一适当位点处插入质粒克隆载体中;以及-将DNA的第二片段在一适当位点处插入质粒克隆载体中。
15.一种制备转移基因之动物的方法，其包括
(a)自一雌性动物体内分离新近受精的卵;(b)制备如权利要求4至13中任何一项所限定的质粒表达载体，以及(c)将质粒注入雄性前核内，然后使之与雌性核融合以形成一单细胞胚胎。
全文摘要
一种创造动物新品种的方法，其包括(a)得到新近受精的卵；
文档编号C12N15/70GK1030255SQ8810287
公开日1989年1月11日 申请日期1988年4月13日 优先权日1987年4月14日
发明者罗伯特·西马克, 朱利安·R·E·威尔斯 申请人:路明尼斯有限公司