专利名称：细胞生长刺激素及其制造方法
技术领域：
本发明属于微生物生物制品类药物的技术领域，即提供一种治疗伤口愈合和人体特殊组织的修复或再生的由微生物代谢产物经处理而制成的药物和制造该药物的方法。
处理各种伤口是外科临床实践中的一项经常而重要的工作。处理伤口的目的是要使伤口及时而完善地得以愈合。然而，有些伤口的愈合例如骨折愈合是比较困难的，首先，骨折的自然愈合需时较长;其次，对于开放性骨折易出现迟缓愈合甚至不愈合现象。目前国内外治疗骨折迟缓愈合和不愈合症的方法主要有手术植骨(包括显微外科带血植骨)和电刺激(包括电脉冲刺激)法两种，它们均系外科疗法即非药物疗法，并且都存在有疗程长、治疗率低(前者一次植骨仅达50%左右;后者也仅达70%)、病人痛苦大、医疗费用高等缺点。乌利斯特(Urist)近年来发明了一种骨形态发生蛋白(简称为BMP)，虽然实验研究表明它对骨折愈合可能有一定的良好影响，但尚未见有其临床应用并取得显效的病例报导。可以说，迄今为止国内外尚未发现一种能够明显直接促进骨折愈合的药物。此外，对于溃疡(包括窦道和瘘)的处理也是临床外科比较棘手的问题，由于没有一种可直接促进人体细胞生长的药物，通常外科医生只能采用清洁溃疡部位、植皮、给患者加强营养、输血、补充各种维生素以改善其全身情况等“间接”疗法，其疗程长、病人痛苦大是可想而知的。
本发明的目的是要研制一种可用于治疗上述骨折迟缓愈合、不愈合以及溃疡等疾病的特效药，即提供一种能促进细胞生长的注射液，只需要将它注射到患者的骨折部位或溃烂部位，便能有效地促使骨折或伤口愈合。
本发明提供了一种细胞生长刺激素，其特征在于它是一种谢氏金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusXie)代谢产物的提取液，它以无菌血浆凝固酶为主要成份并包含有蛋白质、多肽和乌氨酸、胱氨酸等多种氨基酸。
谢氏金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusXie)是本发明所提供的一种特殊的菌种。谢氏金黄色葡萄球菌同普通的金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusRosenbach)相比较，其特征有明显不同。首先，我们从外观上来看两者的差异，将谢氏金黄色葡萄球菌和普通的金黄色葡萄球菌经电子显微镜放大54800倍后进行观察对比，从视场中明显可见谢氏金黄色葡萄球菌体积大、细胞壁厚实而较坚韧、菌核较大、染色体粗大而明显、分裂时呈完全对称性;而普通的金黄色葡萄球菌则体积较小、细胞壁薄易破损、菌核较小甚至不明显、染色体小或显示不清、呈不对称型分裂。对上述两种金黄色葡萄球菌的特征作进一步的比较，其数据资料列出在表1中。谢氏金黄色葡萄球菌的原始菌种取自一位患股骨骨髓炎(多表1
发性窦道伴增生性骨包壳病)20余年的病人的病灶部位，该菌种已经浙江省药品检验所鉴定，在中华人民共和国卫生部药品生物制品研究所备案。
本发明所提供的细胞生长刺激素用于骨折迟缓愈合和不愈合症特别有效，经杭州市第三人民医院收治的345例骨折迟缓愈合、不愈合的病例来看，治愈率达到95.1%，临床愈合时间(以新鲜骨折患者作对比试验统计)可缩短1/3～1/2。同现有的手术植骨和电刺激疗法相比较，它具有疗程短、治愈率高、适用范围广、病人无明显痛苦、医疗费用低、后遗症少和使用方便、安全等一系列优点。本发明所提供的细胞生长刺激素对于软组织遗疡、甚至患病多年经各种疗法久治不愈的下肢溃疡(俗称“老烂腿”)也有明显疗效。
本发明还提供了一种制造上述细胞生长刺激素的方法，它包括培养基的制备和处理、接种、菌落、培养、药液提取、灭菌和包装等六道工序，其特征在于a)采用谢氏金黄色葡萄球菌作菌种;
b)培养基用猪心肌、蛋白胨、氯化钠和水作原料，前三者的配比(以10，000毫升培养基计算)为猪心肌5，000克蛋白胨100克氯化钠50克水加至10，000毫升c)培养基的制备和处理包括煮沸、去渣、过滤和高压灭菌四个步骤，其PH值为7.5;
d)谢氏金黄色葡萄球菌的培养工艺条件为每500毫升培养基中加入浓度为2×109/毫升的菌液1.0毫升在37℃培养48小时;
e)药液提取由多道过滤和除菌两个步骤组成。
为了确保本发明的细胞生长刺激素的质量，防止谢氏金黄色葡萄球菌菌种变异是十分必要的。故在接种工序之前，最好先将一支谢氏金黄色葡萄菌原种菌株用生理盐水0.25毫升溶解置于斜面(或手板)上，放入培养基中在37℃下培养24小时，作变异检查。经变异检查合格后的菌落，方可用少量生理盐水冲洗下来，配制成为适合于培养工艺条件所需浓度的生产用菌液。
本发明所提供的细胞生长刺激素为淡黄色透明的注射液。通常可在4～10℃的环境温度下保存，也可用真空干燥法制成为粉剂长期保存。为了提高注射液的有效贮存期限，可以在注射液中添加一定数量的苯酚作防腐剂，苯酚的加入量(以重量百分比计算)以0.2～0.3为宜。
采用上述制造方法所制造的细胞生长刺激素，进行毒理试验、急性和亚急性毒性试验、过敏试验、热原试验、局部刺激试验、溶血试验、鲎试验、无菌检查以及肠毒素试验、降压物质试验等一系列检验，其检验结果均符合卫生部和《中国药典》的有关规定。其中小白鼠急性半数致死量LD50为344.8±16.6mg/kg，证实所制造出来的细胞生长刺激素使用安全、无毒。骨髓细胞核试验、Ames试验、U.D.S试验结果均为阴性，致畸、致癌观察随访1～5年，结果均属阴性，这些进一步说明了本发明近提供的细胞生长刺激素及其制造方法具备实用性，药物本身无毒性和明显副作用，可以在临床上推广应用。
本发明所提供的细胞生长刺激素及其制造方法，其实施例如下(一)培养基的配制和处理。培养基以猪心肌、蛋白胨、氯化钠和水作原料，各组分的实际配比(以重量百分比计算)如下猪心(洗净沥干)5000克蛋白胨100克注射用氯化钠50克蒸馏水加至10，000毫升先将猪心去血管、血块、脂肪和筋膜，洗净后用蒸馏水冲淋沥干，称重，加2倍的蒸馏水，煮沸2小时，冷却后置冰箱内冷藏12小时，滤去本渣，得滤液;在滤液中加入注射用氯化钠和蛋白胨，煮沸溶解后过滤，再用10%的Hcl调至PH值为3～4。必要时加注射用活性炭50克，继续加热煮沸15分钟，趁热用纸浆过滤除炭。加蒸馏水至全量，并用NaOH液调至PH值7.5(若调PH值后，溶液变得混浊应加过滤以澄清)，最后于500毫升盐水瓶中以铝盖密封。培养基封瓶后需经10公斤、30分钟或15公斤、20分钟高压灭菌处理，并在冷却至室温后保存备用。
(二)接种和培养。取原种菌株一支，用生理盐水0.25毫升溶解后，移种在斜面(或平板)上，经37℃培养基培养24小时，经变异检查合格后，将斜面(或平板)上的菌苔用少量生理盐水冲洗下来，配成20亿个细菌/毫升的浓度，用细菌比浊标准管粗调(10-8稀释后菌落计数核心)于每500毫升培养基中加入1.0毫升的菌液，在37℃下培养48小时，最好每2小时观察并校正一次培养基温度。
(三)提取药液。将上道工序中经37℃、48小时培养基培养的菌液，至少过滤两次，得淡黄色澄清的滤液。将滤液再除菌和过滤，并抽样作无菌检查。检查合格之无菌滤液即为制造好的细胞生长刺激素注射液。考虑到长期保存的需要，可采用真空干燥法将其制成粉剂;或者在上述注射液中加入(以重量百分比计算)0.2～0.3的苯酚作防腐剂，分装入2毫升的安瓶中，封口，在4～10℃下冷藏待用。
权利要求
1.一种细胞生长刺激素，其特征在于它是一种谢氏金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaurusXie)代谢产物的提取液，以无菌血浆凝固酶为主要成分并包含有蛋白质、多肽和乌氨酸、胱氨酸等多种氨基酸。
2.一种专用于制造按权利要求1所述的细胞生长刺激素的方法，它包括培养基的制备和处理、接种、菌落培养、药液提取、灭菌和包装等六道工序，其特征在于a)采用谢氏金黄色葡萄球菌作菌种;b)培养基用猪心肌、蛋白胨、氯化钠和水作原料，前三者的配比(以10，000毫升培养基计算)为猪心肌5000克，蛋白胨100克，氯化钠50克，水加至10，000毫升;c)培养基的制备和处理包括煮沸、去渣、过滤和高压灭菌四个步骤，培养基PH值为7.5;d)谢氏金黄色葡萄球菌的培养工艺条件为每毫升培养其中加入浓度为2×109毫升的菌液1.0毫升，在37℃下培养48小时;e)药液提取由多道过滤和除菌两个步骤组成，并在4～10℃下保存。
3.按权利要求2所述的细胞生长刺激素制造方法，其特征在于药液可用真空干燥法制成粉剂保存。
4.按权利要求2所述的细胞生长刺激素制造方法，其特征在于药液可加入(以重量百分比计算)0.2～0.3的苯酚作防腐剂。
全文摘要
本发明提供了一种细胞生长刺激素，其特征在于它是一种谢氏金黄色葡萄球菌(Staphy lococcusaureus Xie)代谢产物的提取液，以无菌血浆凝固酶为主要成分并包含有蛋白质、多肽和乌氨酸、胱氨酸等多种氨基酸。本发明还提供了一种细胞生长刺激素的制造方法，其特征在于采用猪心肌，蛋白胨和氯化钠的水溶液作培养基，将菌种在37℃下培养48小时直接提取无菌代谢产物。本细胞生长刺激素对骨折迟缓愈合，不愈合以及溃疡等疾病有特效。
文档编号C12P21/00GK1044468SQ8910501
公开日1990年8月8日 申请日期1989年1月28日 优先权日1989年1月28日
发明者谢旭明, 朱正中, 徐寿春, 王江 申请人:杭州市第三人民医院