专利名称：淀粉酶解培养酒精酵母及装置的制作方法
技术领域：
本发明与酵母的培养技术有关，更具体地说是关于酒精酵母培养技术及有关装置的改进。
酒精酵母在微生物分类中属于子囊菌纲，内孢霉目、酵母科、酵母属(Saccharomyces)的一个种，即啤酒酵母种(SaccharomycesCerevisiac)。它能够把单糖(葡萄糖、果糖等)、双糖(蔗糖、麦芽糖等)和少量三糖(如棉子糖)在好氧条件下，培养产生酒精酵母菌体;在厌氧条件下，酒精酵母利用低聚糖(1-3糖)产生酒精。
常规的发酵法培养酒精酵母，有间歇培养和半连续培养等两种方法。间歇培养法淀粉经糖化制成的糖化醪，经杀菌先在小酒母罐中接种培养，再接入大酒母罐中培养出成熟酒母。打出酒母，罐体经洗刷、杀菌后再进行下一次酒母培养。这种方法设备利用率低，培养周期长，每次要添加新酒母菌种。
半连续培养法是采用分割法培养酒精酵母，培养成熟的小酒母罐酒母，分割出三分之二接入大酒母罐中进行培养，余下的三分之一再补加新鲜酒母糖化醪连续培养，培养成熟后再分割。这个方法可以1-2个月换一次新菌种，减少繁琐的实验室阶段培养，但是大酒母罐的培养仍没有摆脱间歇培养方法。在这种方法中，淀粉糖化与酒精酵母培养都是分开进行的，淀粉转化为单糖或双糖，经过杀菌后，淀粉酶失活，再接入菌种进行酒精酵母培养。
广西桂平糖厂曾采用了培养液体曲的同时接入酒精酵母。先把培养成熟的液体曲种子接入带升式培养罐培养8小时，然后接入酵母种，继续培养32小时，得到成熟酒精酵母。这种混合菌培养方法使淀粉糖化与酒母培养在一个培养罐中进行，省略了糖化醪杀菌操作。但总体来看。该方法仍然没有摆脱间隙培养方法，培养周期长，设备利用率低。
本发明的目的在于提供一种培养周期短、设备利用率高，生产过程稳定，酵母活力高的酒精酵母培养方法。
本发明的解决方案是采用一种连续培养酒精酵母的方法。经过予处理的蒸煮醪，先加入淀粉水解复合酶，再连续导入事先已接种酒精酵母菌的酒母培养塔中。进行淀粉糖化和酒母培养的双边发酵过程，成熟酒母从塔体中连续取出。本发明采用了以下培养工艺(1)淀粉或淀粉质原料经蒸煮糊化制成蒸煮醪;
(2)制成的蒸煮醪进入予糖化罐，加入淀粉水解复合酶，制成酒母培养基质;
(3)在酒母培养塔中接种酒精酵母菌;
(4)把酒母培养基质与适量空气混合后，从塔底连续导入酒母培养塔进行连续培养。
(5)从酒母培养塔上部连续取出成熟酒母;
(6)从酒母培养塔的顶端连续排出气体。
(7)用呼吸商控制酒精酵母的培养过程。
现有酒精酵母的培养方法，蒸煮醪进入糖化罐之后，加入麸曲、液体曲。糖化2～4小时以上，淀粉蒸煮醪在糖化罐中基本上全部糖化之后，杀菌再进入酒母罐中作酒母培养。本发明的一个重要特点是淀粉蒸煮醪在予糖化罐中加入淀粉水解复合酶之后，在予糖化罐内停留时间很短，一般只有0.5～1小时。淀粉在予糖化罐中只进行部分水解，淀粉的糖化率一般为20～40%，大部分淀粉是进入酒母培养塔之后，边进行淀粉糖化，边进行酒母培养，在培养塔内进行着双边发酵过程。淀粉水解成的单糖、双糖提供了酵母生长的养分，促进酵母生长，酵母菌吸收利用了单糖、双糖，反过来又加快了淀粉糖化速率。试验表明酵母生长速率和培养介质中被酵母吸收利用的耗糖率达到一种动态平衡，即培养基中糖的生成率与酵母菌体生长的耗糖率相等，所以这种双边发酵过程可以大大提高淀粉水解速度从而缩短酒母的培养周期。
在本发明中提高淀粉水解速率的重要因素是所用的淀粉水解酶，不同于现有技术中使用的黑曲霉或UV-11等变异菌株产生酶，而是一种复合酶。现有技术中使用的黑曲霉或UV-11等变异菌株，产糖化酶酶活力很高，但是产α-淀粉酶和蛋白酶极少，一般α-淀粉酶含量小于2单位/克，原料，因而造成淀粉在糖化过程中糖化速度慢。本发明中所用的复合酶，其中含有糖化酶200～300单位/克.原料，α-淀粉酶5-30单位/克.原料，蛋白酶10-20单位/克.原料，及适量的其他酶制剂。当然也可以不含蛋白酶。这种复合酶制剂可以由两种方法得到一种是在现有的糖化酶产生菌，如黑曲霉或UV-11等变异菌株产生酶中，增补了部分缺陷酶，如α-淀粉酶、蛋白酶;另一种方法是用各种酶制剂如糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶及其他酶制剂。按比例人工复合制成糖化酶酶制剂复合物。如此配制成的复合酶制剂克服了现有技术中使用麸曲、液体曲存在的缺陷，大大地提高了淀粉糖化速率。
本发明的另一个重要特点是所说的酒精酵母培养工艺是一个连续培养工艺，酒精酵母菌是一次接种于培养塔中，尔后从塔底连续补充新鲜培养基，并从培养塔的上方连续取出成熟酵母。实现这种连续培养酒精酵母的工艺，包括以下步骤a、对培养塔作空塔灭菌处理;
b、控制塔内培养基到一个恒定温度;
c、对菌体作酸性驯化处理;
d、把酒精酵母菌体接种于培养塔内;
e、补料培养酒精酵母菌;
f、由补料培养转入连续培养。
由补料培养转入连续培养这个过程，主要通过调节培养基质的稀释率来达到。初期应控制一个较低的稀释率(D)，而后逐步提高，使系统逐渐由间歇不稳定状态逐步过渡到连续稳定状态，同时把补料培养期间生成的一些衰老细胞逐步洗出，以保持系统中培养菌体的活性。进入连续培养之后，塔内培养基质的稀释率通常控制在0.05～0.35(hr-1)范围内。
在本发明所述的连续培养体系中，培养液里的乙醇浓度，基质浓度和盐浓度常常会有波动。由此带来培养液的渗透压也会在一定范围内变动，从而影响菌体的正常生长。所以本发明中所使用的酒精酵母菌不同于间歇培养方法中所使用的酒母，在本发明中酒母菌在接种之前，需经过酸性驯化。其驯化方法包括以下几个步骤。
(1)摇瓶培养。在摇瓶中逐渐降低摇瓶培养基的PH值，使菌体在较低PH值下得到驯化，反复多次分离纯化菌株。
(2)扩大适应性培养。把(1)中分离的菌株，再经过斜面保藏、出发菌株、250ml三角瓶、500ml三角瓶及2升培养罐等扩大适应性培养步骤，使驯化后菌株性状逐渐稳定下来。以上各个步骤的培养条件如表1所列。
(3)把(2)中得到的菌株，在2升培养罐中用连续培养的方法逐渐降低培养介质PH值，淘汰对酸性敏感的菌株，并分离纯化驯化后的耐酸菌株。
经过这样处理的菌株，在偏酸性的环境中，菌株比生长速率和菌体得率不受其影响。培养液渗透压变化对菌体生长特性影响甚微。通过驯化使菌株生理生态特性适应新的环境表现出新的性状，具有培养粗放的特性，提高了菌体活力。增强了菌株抵抗杂菌污染的能力。这种菌株对介质的PH适应范围宽，可在PH3.0～6.5的培养基中正常生长。为表明本发明所用菌株的进步性，用摇瓶试验对经过驯化的菌株与未驯化菌株的发酵性能作了比较。所用菌株为S.cerevisiaeKG。试验方法是将驯化与未驯化菌株分别接种于液体生长培养基的三角瓶中，置于28℃恒温室的旋转摇床上，培养24小时后，测定其菌体浓度及菌体生长强度。测定结果见表2。
由表2中可以看出，经过本发明驯化菌株可在PH4.3±0.5的培养基中正常生长。用这种酒精酵母菌一次接种于培养塔中，其接种率为10%。
在酒母培养过程中需要通入适量的无菌空气。氧的存在减少了酒母培养过程中产生酒精的趋势和二氧化碳对菌体生长的影响，提高了菌体的活性。但又不使该菌体处于高的氧化状态，以便为后续发酵提供高活性高发酵力的菌体。通入的空气量以每分钟每立方醪液中通入空气的立方数(VVm)表示，一般控制在0.5～2.5VVm。通入适量空气还可以控制培养基中乙醇的浓度，空气不断把酒母培养过程中产生的乙醇从培养液中提取出来，以减少乙醇对酵母活性和生长行为的影响。在本发明中，每排出一立方米气体可带出乙醇0.5～2.5kg，培养液中乙醇含量一般小于0.5%(体积%)。
按常规的方法，用菌体浓度、菌体生产强度，细胞出芽率和死亡率，以及介质酒精浓度等项指标。对本发明培养出的酵母质量进行了评价，并与间歇法作了比较。选用菌株为S.cerevisiae-KG，评价方法为菌体浓度和菌体生产强度为重量法;细胞出芽率和死亡率用血球计数法;介质酒精浓度用气相色谱法来测定。测定结果见表3。
从表中可以看出，用本发明所述的连续培养方法，得到的SaccharomycesCerevisiae.细胞其生产强度达到5克/升.小时，是间歇培养法的20～30倍，细胞浓度达到30克/升以上，细胞活力高，死亡率小于1%，出芽率大于20%，细胞质量均一，系统操作稳定。
本发明所述的培养方法，亦可用于其他菌株的培养，凡能将单糖或双糖转化成为酒精或菌体的任何菌株都可使用。如啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)中的酒精酵母德国2号(S.cerevisiaeRasseⅡ)、德国12号(S.cerevisiaeRasseXⅡ)、K氏酵母(S.CerevisiaeRasse-K)、南阳酵母1300(AS1300)、南阳混合酵母(AS1308)等，以及它的变异菌株或菌体融合菌株，这些菌株适于酒精发酵，属于厌氧兼性菌，在好气条件下进行生长，厌氧条件下发酵产生酒精。这些已知菌株均已列在中国微生物所发表的菌种目录中。
此外，粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomycesporube)适用于酒精发酵菌株、卡斯伯酵母(SaccharomycesCarlsbergensis)适用于啤酒、果酒生产的菌株。这些菌株具有菌体比生长速率较低，菌体生长过程有副产物酒精生成的特性。它们也可用本发明所述的培养方法进行培养。
本发明所述的连续培养酒精酵母菌的过程，可以用一个呼吸商(RQ)值进行控制。所说的呼吸商是培养体系中CO2生成速率与O2消耗速率的比值，呼吸商可以间接地反映酒精酵母的发酵(生长)状态。通过对培养塔尾气中氧和二氧化碳含量的测定可以得到所需的呼吸商。
为实现本发明提出的连续培养酒母的方案，本发明还特别设计了一种酒母培养塔。如附图2所示，塔内包括一个气升式内循环培养腔体(10)和一个酒精酵母菌液分离腔(8)。培养腔是由内外两只圆筒体构成。所说的分离腔是一只直径大于培养腔外圆筒的筒体。分离腔与培养腔外圆筒的直径比为1.65∶1，分离腔处在培养腔的上方并与之成一整体，培养腔与培养液分离腔的体积比为0.45～0.56。在分离腔中有一个分离菌液的出口(5)。在分离腔的上方有一个气室(7)和一个气体排出口(6)，气体排出口与一只气液分离器(14)相连。在气液分离器上装有呼吸商检测器(15)在培养腔底部的培养基质进口处，还有一只气液混合器(3)，如此就构成一台完整的酒精酵母培养塔。
加有淀粉水解复合酶的酒母培养基质，与适量的无菌空气(12)在气液混合器(3)中混合后进入酒母培养塔。流体沿培养腔的内圆筒(9)向上移动，流体的上升力带动外圆筒(11)的部分成熟酒母培养液进入内圆筒，在筒内相互混合，并不断地进行淀粉糖化和酒母培养的双边发酵过程。流体离开培养腔的内圆筒进入分离腔后，流体流速迅速下降，气体逐渐自液流中逸出，被带出的乙醇经分离器分离回收。部分成熟酒母在上升气体的依托下，在分离腔内继续上升，从分离菌液出口处(5)取出供酒精发酵工序使用。由于分离腔体积较大，有相当一部分成熟酒母培养液滞留在分离腔中。滞留的酒母培养液由于塔底所流入流体的牵引和自身的重力作用。部分成熟酒母沿培养腔外筒体(11)下行，再与新进入培养塔的培养基混合，如此在培养腔内形成一个气升式内循环，使酒母培养过程连续进行下去。
下面再结合附图对本发明的发酵工艺流程作进一步说明。
图1为本发明的发酵工艺流程简图;
图2为本发明中培养塔的剖面结构示意图。
附图1中，淀粉或质原料经蒸煮糊化制成蒸煮醪(16)进入予糖化罐(1)，并加入淀粉复合水解酶(17)，制成的酒母培养基质(2)与无菌空气(12)经气液混合器(3)进入酒母培养塔(4)。在酒母培养塔中予先接种上一种酒精酵母菌，接种量为10%，培养介质的温度控制在28+1℃。新进入的培养基质与塔内培养液混合，在培养塔的培养腔(10)内循环培养。成熟酒母进入酒母菌分离腔(8)，从分离菌液出口(5)取出供发酵工序使用。混入培养液中的气体，自培养液中逸出，经气室(7)从气体排放口(6)排放。排出的气体先经气液分离器(14)回收带出的乙醇(19)，气体经一只空气过滤器(13)过滤后排空。在分离器上还装有呼吸商检测器(15)，用以控制酒母培养过程一只高300mm，容量为2升的培养塔，按本发明所述的方法进行连续培养，对于S.cerevisiae-KG。酒精酵母菌株。每小时可产酒精酵母菌液0.25升，所得酒母菌液的酵母细胞浓度为30克/升，酵母菌体生产强度为5克/升·小时，细胞死亡率小于1%，细胞出芽率大于20%，细胞形态正常。
本发明的优点是很明显的，酵母在培养塔中一次接种，从塔底连续补充新鲜培养基，并从培养塔的上方连续取出成熟酵母。控制各种环境因素，使酵母处于适宜的稳定环境中，因而，酵母培养过程可以长时间地、连续地进行。它与传统的间歇培养技术相比，具有培养周期短、酵母活力高，细胞活力均一，设备利用率高，生产过程稳定，便于实现自动控制。本发明所述的酵母连续培养方法是一种真正的人为控制的微生物定向培养，提高了酵母培养质量。降低了成本。本发明设计的培养塔，采用内循环气升式结构，设备内部无机械运动部分，结构简单，并可大大降低设备投资费用和维持操作费用。总之本发明提供的酒母连续培养方法，工艺流程简单，生产过程稳定，提高了生产效率，为连续培养酒母找到了一条有工业价值的新途径，具有明显的经济效益与社会效益。
下面再用几个实例进一步说明本发明，当然并不局限于这几个实例。在以下实例中均以图1所示装置进行连续培养过程。
例1，用酒精酵母(S.cerevisiae KG)菌株进行连续培养。培养介质淀粉30%;MgSO4.7H2O 1%;(NH4)2SO40.5%;KH2PO40.8%;酵母膏0.6%;FeSO4.7H2O 0.02%，经连续蒸煮(灭菌121℃，1Kg/cm2表压，停留时间30min)，真空冷却后，在连续糖化状态下，加入淀粉水解复合酶(糖化酶酶制剂复合物糖化酶250单位/g淀粉，α-淀粉酶20单位/g淀粉)。糖化醪在罐内停留时间为0.5hr，糖化温度60℃，经冷却送入培养罐。
培养过程控制培养温度28℃，pH4.3，通风量1.82VVm稀释率为D＝0.21hr-1，菌体浓度28.5g/l，菌体生产强度5.99g/l.hr。细胞活性出芽率25%，死亡率＜1%例2用酒精酵母(S.cerevisiae KG)菌株进行连续培养。培养介质淀粉30%;MgSO4.7H2O 1%;(NH4)2SO40.5%;KH2PO40.8%;酵母膏0.6%;FeSO47H2O 0.02%。经连续蒸煮(灭菌121℃，1kg/cm2表压，停留时间30min)，真空冷却后，在连续糖化状态下，加入淀粉水解复合酶(uv-n-48的液体曲以糖化酶为基准，250单位/g淀粉，α-淀粉酶15单位/g·淀粉)。糖化醪在罐内的停留时间为0.5hr，糖化温度为60℃，经冷却送入培养罐。
培养过程控制培养温度28℃，pH4.3，通气量1.75VVm稀释率0.13hr-1，得到菌体浓度38.2g/l，菌体生产强度4.97g/l。hr;细胞活性出芽率32%;死亡率＜1%。
例3 用酒精酵母(S.cerevisiae KG)菌株进行连续培养。培养介质淀粉质原料-薯干粉35%;(NH4)SO405% MgSO4·7H2O 1%;KH2PO40.8%;酶母膏0.6%FeSO4·7H2O 0.02%(经过连续蒸煮(灭菌138℃2.5kg/cm2表压，停留时间90min)，真空冷却后，在连续糖化状态下，搅拌加入淀粉水解复合酶(糖化酶酶制剂的复合物糖化酶250单位/g淀粉;α-淀粉酶，20单位/g淀粉;蛋白酶10单位/g淀粉，和其它酶类)糖化醪在罐内停留时间为05hr糖化温度60℃，经冷却送入培养罐。
培养过程控制培养温度28℃，PH4.2，通风量167VVm，稀释率D＝0.15hr-1菌体浓度＝29.5g/l，菌体生产强度为4.43g/l·hr，细胞活性出芽率30%，死亡率＜1%。
例4 用粟酒裂殖酵母(Shizosuccharomyces porube)菌株进行连续培养。培养介质淀粉30%;MgSO4·7H2O 1%;(NH4)2SO40.5%;KH2PO40.8%;酵母膏0.6%;FeSO4·7H2O 0.02%。经连续蒸煮(灭菌121℃，1kg/cm2表压，停留时间30min)，真空冷却后，在连续糖化状态下，搅拌加入淀粉水解复合酶(糖化酶酶制剂复合物糖化酶250单位/g淀粉，α-淀粉酶20单位/g淀粉)。糖化醪在罐内停留时间为0.5hr，糖化温度60℃，经冷却送入培养罐。
培养过程控制培养温度28℃，PH4.8，通风量157VVm稀释率D＝0.11hr-1，得到菌体浓度41g/l，菌体生产强度4.5g/1.hr。细胞活性出芽率28%，死亡率＜1%。
权利要求
1.一种淀粉酶解培养酒精酵母的方法，包括淀粉水解糖化和酒精酵母细胞培养等过程，其特征在于所说的培养方法是一种连续培养方法，经予处理的蒸煮醪，先加入淀粉水解复合酶，再连续导入已接种有酒精酵母菌的酒母培养塔中进行淀粉糖化和酒精酵母培养的双边发酵过程，成熟酒母从塔体中连续取出，其培养工艺包括以下主要步骤1·1淀粉或淀粉质原料蒸煮糊化制成蒸煮醪；1·2制成的蒸煮醪进入予糖化罐，加入淀粉水解复合酶制成酒母培养基质；1·3在酒母培养塔中接种酒精酵母菌；1·4把酒母培养基质与适量无菌空气混合后，从塔底连续导入酒母培养塔进行连续培养；1·5从酒母培养塔上部连续取出成熟酒母；1·6从酒母培养塔的顶端连续排出气体；1·7用呼吸商控制培养过程。
2.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于步骤1.2中蒸煮醪在予糖化罐内的停留时间为0.5～1小时。
3.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于在步骤1.2中淀粉在予糖化罐内部分水解，淀粉的糖化率为20～40%。
4.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，在步骤1.2中所说的淀粉水解复合酶的特征在于其中含有糖化酶200～300单位/克.原料，α-淀粉酶5-30单位/克.原料、蛋白酶10～20单位/克.原料及适量的其他酶制剂。
5.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于要实现所说的连续培养酒精酵母的工艺，还需包括以下一些步骤5.1 对培养塔作空塔灭菌处理;5.2 控制塔内培养基到一个恒定温度;5.3 对菌体作酸性驯化处理;5.4 把酒精酵母菌体接种于培养塔内;5.5 补料培养酒精酵母菌;5.6 由补料培养转入连续培养。
6.按照权利要求1和5所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于酒精酵母菌是一次接种于培养塔中，所用的酒精酵母菌是经过酸性驯化的酒精酵母，这种菌株可在PH3.0-6.5的培养基中正常生长。
7.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于在步骤1.4中所说的无菌空气通入量为0.5VVm～2.5VVm。
8.按照权利要求1和5所说的培养酒精酵母的方法，其特征在于进入连续培养之后，培养基质在培养塔内的稀释率为0.05～0.35(hr-1)。
9.按照权利要求1所述的培养酒精酵母的方法，其特征在于在培养塔中培养基质里酒精含量为0.5%(体积%)。
10.按照权利要求1所述的酒母培养塔，其特征在于塔内包括一个气升式内循环培养腔体和一个酒精酵母菌液分离腔，分离腔处在培养腔的上方并与之成一整体，在分离腔中有一个分离菌液的出口。在分离腔的上方有一个气室和一个气体排出口，气体排出口与一只气液分离器相连，在气液分离器上装有呼吸商检测器。
11.按照权利要求10所述的酒母培养塔，其特征在于所说的培养腔与培养液分离腔的体积比为0.45～0.56。
12.按照权利要求10所述的酒母培养塔，其特征在于所说的分离腔是一只直径大于培养腔外圆筒的筒体，分离腔与培养腔外圆筒的直径比为1.65∶1。
13.按照权利要求10所述的酒母培养塔，其特征在于在培养腔的底部的培养基质进口处还有一只气液混合器。
全文摘要
一种淀粉酶解连续培养酒精酵母的方法，蒸煮醪先加入淀粉水解复合酶，再连续导入已接种有酒母菌的气升式内循环酒母培养塔中。进行淀粉糖化和酒母培养的双边发酵过程，成熟酒母从塔中连续取出，整个培养过程用呼吸商控制。一只2升的培养塔每小时可产成熟酒母7.5克。当稀释率D＝0.05～0.35(hr
文档编号C12P7/06GK1069066SQ9210662
公开日1993年2月17日 申请日期1992年7月24日 优先权日1992年7月24日
发明者管斌 申请人:山东轻工业学院