专利名称：生产纳他霉素的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种特征在于种菌制备、种菌繁殖以及发酵的生产纳他霉素的方法。
纳他霉素是抗真菌的多烯族中的一个成员。化合物纳他霉素是一个分子量约为666，相应的实验分子式为C33H47No13的四烯，并且它包含一个配糖连接的碳水化合物部分，放线菌糖胺。纳他霉素的等电点约pH6.5，并以两种典型构型存在烯醇结构和酮基结构。
在美国人Cyanamid的英国专利No.846，933(1960)中描述了生产纳他霉素的传统方发酵方法。该英国专利No.846，933的描述被参考结合于本文中。
尽管纳他霉素具有抗生和抗真菌的价值，但是该产品的商业用途很小。这就受限使用的一个主要原因是过高的生产成本。
本发明的目的是克服传统的低效率并提供一种通过在预定的培养基中繁殖和发酵种菌，以成本可行的方式生产可用量纳他霉素的方法。
本发明涉及用能生产纳他霉素的有机体进行的发酵，具体地说，本发明指导在发酵时产生纳他霉素的含有链霉菌属种菌的制备(如孢子形式)和繁殖。将该链霉菌属的种菌放在一系列预先确定的环境和/或培养基中，使纳他霉素的生产提高产率。
通过给链霉菌属种提供一个改进的环境，可以把纳他霉素的产率提高到至少大约5至约12g/l的范围内。已经发现通过使用种菌繁殖和发酵培养基，可以得到提高很多的纳他霉素产率
1.对种菌繁殖适合的培养基含有a)一种量为大约2-16g/l的蛋白质氮源，一般约为8g/l;和b)以足以避免全部碳耗尽的量存在的可吸收碳源，通常为培养基的5-30g/l，且一般为约15g/l;
2.在发酵期间为了诱导种菌生产纳他霉素所用的适宜的培养基含有a)约80-250g/l的可代谢碳源;和b)含高水平蛋白质和微量元素的蛋白质氮源。蛋白质氮源一般包括非发酵蛋白质氮成分和发酵蛋白质成分。希望这两种蛋白质氮组分以一个比例范围存在，相应地以蛋白质的量为基础从约5∶1到11∶1，最好为约8∶1。
使用具有上述特征的培养基是本发明促使链霉菌属的种以成本合适的方式生产纳他霉素的主要方面。
图1是本发明所用的种菌繁殖方法的示意方块图。
图2发酵过程中三个阶段的示意图。
根据本发明，把能产生纳他霉素的微生物与预先确定的培养基接触，产生一个种菌，然后再放在在进一步繁殖和纳他霉素生产发酵期间，使微生物保持最大代谢活性的预先确定的发酵生产培养基上。发酵期间，该微生物至少将部分预先确定的生产培养基酶促地转化成纳他霉素。
任何含有可产生纳他霉素的链霉菌的菌种均可用于本发明。优选的链霉菌种包括Streptomycesgilvosporeus该菌种已保存在美国，Maryland，Rockville的美国典型培养物收集中心(ATCC)，寄存号为ATCCNo.13326。
从合适孢子的孢子悬浮液制备种菌。随后，当该适宜的链霉菌种的种菌放在本发明的发酵培养基上发酵时产生高产率纳他霉素。将该种菌进行一系列的繁殖步骤，其中每一步均提高生产纳他霉素的链霉菌种细胞的数量。当链霉菌细胞的量充足后，把链霉菌放在链霉菌种发酵时用来扩增纳他霉素生产的环境和/或培养基上。
孢子悬浮液通过收集生产纳他霉素的链霉菌种的孢子开始生产种菌，链霉菌种从美国典型培养物收集中心获得。使孢子发芽以发生链霉菌种的活性生长培养物。用链霉菌种(如.Streptomyces gilvosporeus或任何其他纳他霉素生产菌种的活性生长培养物密集地接种在无菌(如.高压灭菌)的琼脂斜面上，并培养直到孢子大体覆盖了整个斜面。把琼脂斜面上的孢子刮到少量的液体，如水(例蒸馏水)，营养培养基等中，以产生孢子的水悬浮液。繁殖所得的孢子悬浮液使其生产用于发酵过程(即，纳他霉素生产)的种菌。为了达到最好结果，开始种菌繁殖所用的孢子悬浮液应包含的孢子浓度为约105-1010CFU/ml，并且，一般至少约为108CFU/ml。
若干琼脂培养基可用于促进链霉菌种(例如S.gilvosporeus培养物的孢子形成，用于形成孢子悬浮液。适宜的典型琼脂培养基至少含有下列组分中的一种酵母麦芽琼脂，Hickey-Turner琼脂，GYA琼脂，Pridham琼脂，土豆薯右旋糖，Benett′s琼脂，等。
在孢子悬浮液中高浓度(例如108CFU/ml)的可发芽孢子是本发明的一个关键。首先，如果孢子浓度太低，整个种菌繁殖，将要花很长时间得到足够量的链霉菌种细胞，这样才能进行成本合算的纳他霉素发酵生产。第二，悬浮液内减少的孢子量将延长全部种菌繁殖的时间并增加污染(如，由有害生物引起)的可能性。此外，悬浮液内的低孢子浓度会导致大的，紧密的叠集的菌丝体颗粒。由于与氧转移，营养物质转移到颗粒中等问题相连，这些颗粒不适于得到高产率的纳他霉素。由于菌丝体颗粒是不希望的，可通过物理方法破坏颗粒，如使用剪切力(如，掺合)。
种菌繁殖把上面讨论的孢子的水悬浮液(如.S.gilvosporeus)发芽并继续增殖直至微生物的数量足够用于进行发酵生产纳他霉素的水状接种。适宜的种菌细胞密度含有约1-5g/l的干细胞重，并且是纳他霉素生产培养基体积的约0.1-10%。
用于种菌繁殖的含水培养基决定细胞密度和种菌的代谢状态(如.需要足够密度的健康细胞)。需要足够的一般存在于蛋白氮源的复合生长因子(如维生素)，无机元素(如，钾、钠、钙、等)，和微量元素(如，硼、钴、铁、铜、铁、等)的蛋白氮以得到有所需细胞密度和代谢状态的种菌，蛋白氮可以是任何来源的，它们能将孢子悬浮液繁殖成可生产所需的高产纳他霉素的种菌。
还必须以一个足以得到所需种菌细胞密度的量，给含水种菌培养基提供可代谢的碳源。为了得到最佳效果，在种菌繁殖期不应完全耗尽碳源。碳源的耗尽会导致有害地改变种菌的代谢状态，从而降低发酵期间纳他霉素的产率。
虽然根据本发明可以有效地使用各种含水种菌培养基，但为了得到高产率的纳他霉素，使用预先确定量的培养基组分是有好处的。
合适的用于种菌繁殖的培养基可以用水(如，低矿物质水，蒸馏水，等)制备，并含有a)含量为约2-16g/l，一般为约8g/l的蛋白氮源;
和b)以足以避免全部碳耗尽的数量存在的可代谢碳源，其量通常为培养基的5-30g/l，且一般为约15g/l。
下面给出适于种菌繁殖的两种具体的培养基组合物组合物1数量Difco“Bacto”胨5g/l玉米浸渍液3g/l氯化钠10g/l葡萄糖15g/l组合物2数量Hormel胨PSR58g/l氯化钠10g/l葡萄糖15g/l提供营养增加链霉素生产速度的种菌培养基可以通过传统技术(如在约120-140℃分别或同时灭菌碳和氮源)制备。种菌培养基灭菌后，适宜的pH约为7。把孢子悬浮液加入到种菌培养基中，并把种菌培养基加热到25-40℃，且一般为约28-35℃。
为了得到大体积的适于纳他霉素发酵生产的含水种菌，需要数个种菌繁殖步骤，每一步完成后的体积都大于上一步骤的体积。例如，种菌繁殖可以以细胞量的指数增加的方式进行。具体的说，通过在每一步繁殖期间有效地增加种菌体积，在使繁殖期间保持培养物以指数生长方式生长是有益的。可以通过最大限度地缩短每一步骤的持续时间或最大限度地缩小步骤次数来做到保持指数生长方式。例如，一旦达到预定的种菌密度，就把种菌转移到一个更大的环境(如，容器)中以进行进一步繁殖。通过有效地控制种菌繁殖，使种菌繁殖花费最少时间和经费，并且相应地提高发酵期间成本合算的纳他霉素产率。
在一系列种菌繁殖步骤中，单一步骤的时间长度继续取决于培养基组合物，所需的链霉素细胞数量，温度，等。一般，完成单一繁殖步骤需约6到至少约24小时。
种菌繁殖过程需要种菌通气。例如，用转搅拌器，以约200rpm搅动盛有种菌的容器或瓶。本发明的一个方面是，种菌用装在盛种菌容器中的叶轮进行搅拌，同时，把无菌空气通入容器底部。
现在谈及图1，该图是用于生产在发酵生产纳他霉素中使用的种菌的方法的示意图，图1说明通过繁殖得到的种菌体积的增加，这对于获得一定量的纳他霉素是必需，所述的一定量的纳他霉素是足够以成本合算的方式生产纳他霉素的量。例如，通过把25升的种菌加到含1225升含水种菌培养基的容器中，来把种菌的体积从25升增加到1250升。
纳他霉素生产在能够容纳发酵过程的发酵容器中进行纳他霉素生产。为了达到最大纳他霉素产率;一个重要因素是含水发酵培养基的组合物。发酵培养基必须含有适量的可吸收的碳和蛋白氮。也就是说，要求培养基含有通常存在于蛋白氮源中的复合的生长因子(如.维生素)，和无机元素(如钾、钠、钙、等)，和微量元素(如.硼、钴、铁、铜、锌，等)。
可以用水(低矿物质的自来水，蒸馏水，等)，并含有a)约80-250g/l的可代谢碳源;和b)至少15g/l，并且一般为约20/l到80g/l的含高水平蛋白质和微量元素的蛋白氮源。蛋白氮源可含有一种非酵母蛋白氮组分和一种酵母蛋的氮组分。两种蛋白氮组分通常以在蛋白质含量基础上的从约5∶1到11∶1的比率范围存在，且为了最佳结果，其比率通常为8∶1。
可以从广泛的来源提供蛋白质氮源。例如黄豆蛋白质产物(如，分离物，粉，粗粉等)可含有非酵母蛋白质氮源(如，用含80-95%蛋白质的黄豆蛋白可获得令人满意的纳他霉素产率)。蛋白质氮源也可包括牛肉提取物，蛋白质水解物(如胨)，和/或酵母(如提取物，自溶物，等)。
如上面讨论的，生产培养基也必须包括可被链霉菌种消化的碳源。可以以任何方式如葡萄糖，多糖，谷物和土豆淀粉，等提供该碳源。
此外，在本发明的一方面，不需要一开始就加入作为纳他霉素生产培养基的，用于生产纳他霉素的全部数量的碳源(如，起初的碳源数量不是以完全发酵)。在本发明的该方面，可在纳他霉素生产期完成碳源的加入以便使碳源的量保持在约5-30g/l，且一般为20g/l。因此，或者在开始和/或在发酵开始后把合适量的适宜碳源加入到发酵介质中。例如，在发酵培养基中，碳源可以以约40-140g/l的量存在。此后，在主发酵期，以至少等于链霉菌在发酵过程中消耗碳源的速率向发酵罐中连续加入碳源(如，以把碳源浓度保持在或大于最低水平)。接近发酵过程末期和主发酵期后，停止加入碳源，以便在发酵循环结束时几乎没有或没有剩余碳源(如，碳源量基本上等于在需完成发酵过程的发酵培养基中具体的碳源量)。
通过传统技术制备给链霉菌发酵和纳他霉素生产提供营养的纳他霉素生产培养基(如，在约120～140℃，分别或同时给碳和氮源灭菌)。灭菌后，生产培养基需要有大约7的pH。
把种菌放到发酵容器中，直到按体积计算，浓度达到生产培养基的0.1-10%，一般约为2%(如种菌的量足够接种许多发酵罐)。发酵罐的剩余体积是发酵培养基。任何以活化代谢状态提供种种菌，把种菌放入发酵罐中生产培养基的技术都是可接受的。
把发酵或生产培养基的温度升到约25℃-40℃，一般为28℃-35℃。发酵过程的时间长度取决于发酵培养基的组合物温度、在种菌中链霉菌细胞的量、所需的纳他霉素量等。一般发酵过程经约70到至少约168小时完成。
在发酵期间，应把氧供给纳他霉素生产培养基。在发酵的主要部分，把在生产培养基中溶解氧的水平保持在约20-80%空气饱和度水平是有益的。可以通过协调通风和/或搅拌速度增加达到适宜溶解氧水平的能力。例如，通过动力空气(如无菌空气)给发酵或生产培养基供气，一般以每发酵培养基空气体和0.3到至少1.0体积的速度通过发酵培养基。本发明的一方面是需通气的同时搅拌发酵培养基。进一步说，通气的速度应足以引起搅拌发酵培养基。
现在谈及图2，该图表明上述过程三个阶段的每一期中时间与纳他霉素浓度之间的关系。第一阶段包括把碳源加入到发酵培养基中，以及链霉菌种的生长和繁殖。第一阶段也伴随有纳他霉素产生。在发酵液中的纳他霉素浓度依链霉菌细胞繁殖的增加而增加。纳他霉素浓度的增加一般与第一阶段的时间成指数性增加。最终，纳他霉素的浓度将随时间而恒定地增加，这表示，已完成纳他霉素生产的第二阶段。(即主要阶段)第三阶段的特征是纳他霉素浓度的平稳阶段(如，可能由于链霉菌种的代谢活性降低引起)。为了确定目前的发酵阶段，可根据时间分析发酵罐中纳他霉素浓度。为了最大限度地得到所生产的全部纳他霉素，需要使用导致迅速达到并保持发酵第二阶段的培养基和/或环境。
在本发明的一个方面，需控制泡沫时，以约0.01%-1%的量(按发酵或纳他霉素生产培养体积算)经发酵培养基中加入抗泡沫剂(如，硅酮脱泡剂)。
加入种菌后，纳他霉素生产培养基的pH为约7.0。在发酵期间，pH缓慢降低到约4.5。pH的降低是链霉菌代谢活性的结果。取决于发酵液使用限度，纳他霉素生产完成后，为了使发酵液的处理更加迅速，所以需要发酵培养基有降低的pH(如，在较高的pH为约7时，发酵液变得相对粘稠，并因而从发酵液中回收纳他霉素可能更困难)。
当恰当地完成本发明时(如，有效地控制链霉菌种菌，选择培养基，等)，一般所得的发酵液将含有至少约5g/l的纳他霉素。在某些情况下，纳他霉素产生的水平可以从约7g/l到至少约12g/l。
可以从生产培养基中分离纳他霉素。在某些情况下，可以从发酵液中提取纳他霉素并结晶。可以在U.K.PatentNo.846，933中找到有关获得结晶体纳他霉素的成熟技术的实施例。
通过下列实施例进一步说明本发明，但该实施例只是为了说明，而不是限制与本发明等同的范围。除非特殊情况，用市售的试剂级材料来完成下列实施例。
实施例在下列试验中，用蒸馏水制备下列组合物的琼脂斜面。
3g/l酵母提取物(Difco“Bacto”YeastExtract)3g/l麦芽提取物(DifcoMaltExtract)5g/l胨(Difco“Bacto”胨)10g/i葡萄糖15g/l琼脂在约121℃把琼脂灭菌约15分钟。
在蒸馏水中制备下列组合物的种菌培养基，并用氢氧化钾把pH调到约7.0。
20g/l葡萄糖10g/l氯化钠6g/l谷物浸渍液(PPM(商标)CornSteepLiquid)6g/l胨(Difco“Bacto”胨)在约121℃把种菌培养基灭菌约15分钟。
从美国典型培养物收集中心得到美国典型培养物收集中心寄存号为No.13326的′Streptomycesgilvosporeus的冻干孢子悬浮液，并把它用作培养源。在约25℃把培养物放在琼脂斜面上，直到培养物孢子形成。
在约10天内;琼脂斜面上密集地形成孢子，并在10-20天后使用。从这些琼脂斜面上刮下孢子放入种菌培养基以制成浓度约108CFU/ml的孢子悬浮液。把约2ml的孢子悬浮液加到在500ml遮光烧瓶中的约100ml种菌培养基中。于29℃将遮光烧瓶中的种菌培养48小时，并用放置搅拌器以200rpm转速搅拌。48小时后，将约4ml的上述培养物加到在1000ml遮光烧瓶中的约200ml种菌培养基中，繁殖种菌。于约29℃再将上述种菌培养约24小时并用旋转搅拌器以200rpm搅拌。用生产出的种菌给81生产培养基接种。
用在本实施例的纳他霉素生产培养基是下列起始组合物19.5g/l黄豆蛋白质分离物(ADM，“profam”S970)4.5g/l酵母提取物(Stauffer，TypeKAT)0.2ml脱泡剂(Mazu，DF289)在14l的发酵罐中用蒸馏水制备生产培养基，并用氢氧化钾把pH调到约7.6。然后在约121℃将发酵罐灭菌约15分钟。将用蒸馏水制的50%的葡萄糖溶液单独灭菌。
接种前，把生产培养基加热到约29℃并加入葡萄糖使葡萄糖的起始浓度为约40g/l。为发酵罐确立约0.3v/v-mim(每分钟每培养基体积的空气体积)的通气率和约300rpm的搅拌率。
把上述含Streptomycesgilvosporeus(ATCC保藏号No.13326)的种菌加到发酵容器中，直到发酵容器的种菌含量为约2%体积。发酵约40小时后，为了保持发酵容器中葡萄糖浓度为20g/l，把葡萄糖加到种菌中。通过以约1g/l-hr的速度给发酵容器提供葡萄糖来完成上述要求。提高发酵容器的搅拌率以把溶解氧保持在约50%空气饱和度的水平。
试验＃1-按上述进行，用起始体积约8.01生产培养基开始发酵周期时间持续约117小时，葡萄糖全部添加量为约110g/l，在8.71发酵液中得到7.3g/l纳他霉素(共64g纳他霉素)。
试验＃2-除下列外，重复试验＃1的方法用稀疏孢子形成的琼脂斜面制备孢子悬浮液，结果，在起始孢子悬浮液中的孢子浓度仅约5×104CFU/ml。在8.71发酵液中，纳他霉素的产率减少到约5.2g/l。(共45g纳他霉素)试验＃3-除下列例外，重复试验＃1的方法把发酵培养基改变成约10g/l葡萄糖，约2g/l牛肉提取物，约2g/l酵母提取物，约0.5g/l天冬酰胺和约0.5g/l二碱磷酸钾。随后加入葡萄糖。生产72小时后，在约0.1l的发酵液中纳他霉素产率是约0.75g/l。
试验＃4-按试验＃1所述的进行，但用pridham琼脂培养孢子且对起始的种菌繁殖步骤仅为12小时，并使用有6g/l酵母提取物和26g/l黄豆蛋白质分离物的培养基，在106小时的发酵周期中加185g/l葡萄糖，在约8.41发酵液中;得到产率约为10.1g/l的纳他霉素(共85g纳他霉素)。
研究本实施例的试验1到4说明，提高种菌中孢子浓度和发酵培养基中营养物质含量可提高可回复的纳他霉素总量。
虽然已详细描述了本发明的一些具体实例，但本领域专业人员很容易理解本发明包含许多组合和变化。
权利要求
1.通过发酵制备纳他霉素的方法，其中a.种菌含有产生纳他霉素的链霉菌培养物；且培养基含有蛋白质氮和超过需要的可吸收碳源以避免在种菌繁殖期间的碳耗尽；和b.纳他霉素生产培养基含有80到250g/l的可代谢碳源，和15到80g/l的蛋白质氮源。
2.根据权利要求1的方法，其中所述培养物是Streptomyces gilvosporeus ATCC13326。
3.根据权利要求2的方法，其中种菌培养基含有2到16g/l的蛋白质氮源和5到30g/l的可吸收碳源。
4.根据权利要求3的方法，其中所述孢子悬浮液含有至少105-1010CFU/ml孢子浓度。
5.根据权利要求4的方法，其中，所述生产培养基含有非酵母和酵母蛋白质氮组分，所述非酵母和酵母组分在蛋白质含量基础上，以5∶1到11∶1的比例存在。
6.根据权利要求5的方法，其中所述比例是8∶1。
7.根据权利要求5的方法，其中，所述非酵母组分是黄至蛋白质氮源。
8.根据权利要求1的方法，其中，碳源在发酵液中的浓度在纳他霉素生产期间保持在5-30g/l。
9.根据权利要求1的方法，其中，每升纳他霉素生产培养基生产至少8g纳他霉素。
全文摘要
一种产生纳他霉素的链霉菌种发酵生产纳他霉素。在预先确定的培养基上繁殖链霉菌种的孢子悬浮液以获得大量链霉菌细胞。将该链霉菌细胞在预先确定的生产培养基上发酵以生产可回收量的纳他霉素。
文档编号C12P19/62GK1071460SQ92110469
公开日1993年4月28日 申请日期1992年8月5日 优先权日1991年8月5日
发明者M·A·艾森申克, J·R·米利斯, P·T·奥尔森 申请人:生物技术资源公司