专利名称：抗肿瘤的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型、高效的抗肿瘤的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法，特别涉及在大肠杆菌中表达的重组脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法。
在现有技术中，已知干扰素是一种具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物学功能的细胞因子，近年来已开始应用于治疗肿瘤病、病毒病和免疫性疾患。但是现有的干扰素产品均不具有专一针对肿瘤细胞的特异性，因而在实用中仍表现出有效剂量大、不同程度地损害正常细胞、以及存在相当程度的不良副反应等缺点。
本发明的目的在于提供一种将干扰素专一导向肿瘤细胞，不会损害正常细胞，即副作用很小、有效剂量小的具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物学功能的脑啡肽-干扰素融合蛋白。本发明的另一目的是提供一种脑啡肽-干扰素融合蛋白的制备方法。
本发明是这样来实施的(1)组成方面是脑啡肽-干扰素融合蛋白，它是氨基端的脑啡肽5肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干扰素166肽部分，两者由中间连接肽3肽(Ser-Gly-Ser)相连，总分子量为21kD。这种融合蛋白的脑啡肽部分负责与肿瘤细胞表面所富含的脑啡肽受体结合，即发挥导向功能，而其中的干扰素部分则负责发挥抗肿瘤细胞生长的功能，而中间连接肽的存在，保证了上述两个生物大分子能独立形成各自的立体构象，从而保证两者均能最大限度地发挥出各自的生理功能，成为一种“生物导弹”。
(2)制法方面，共分6个步骤(ⅰ)脑啡肽基因和连接肽基因的合成是在通用的DNA自动合成仪(美国AppliedBiosystem公司381A型)上采用已知的亚磷酰胺法化学合成。合成片段的结构设计为TCGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC，其中已包括脑啡肽和连接肽的编码区。
(ⅱ)IFN基因的分离是采用冷冻匀浆及蛋白酶，从人的胎肝中提取染色体DNA作为模板进行常规的聚合酶链式反应，扩增出人的干扰素-α1c基因。
(ⅲ)连接用限制性内切酶Ddel切割干扰素-α1c基因产生粘端，与合成基因部分经T4DNA连接酶连接成融合基因。随后将融合基因经连接酶催化连接组装入原核表达质粒pBV220中，经DNA测序证明与设计相符。
(ⅳ)表达融合基因在pBV220中由PRPL串联启动子控制在大肠杆菌中表达重组蛋白，即脑啡肽-干扰素融合蛋白。
(ⅴ)纯化表达的重组脑啡肽-干扰素融合蛋白经抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析纯化后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。氨基酸序列测定结果表明，融合蛋白N端15个残基序列与原设计完全符合。
下面的优选例对本发明的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法作详细说明，但不限制本发明的范围。
脑啡肽-干扰素融合蛋白的基本构成是氨基端的脑啡肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干扰素166肽部分，两者由中间连接肽3肽(Ser-Gly-Ser)相连，总分子量为21kD。
制造方法的例子是(ⅰ)脑啡肽基因和连接肽基因的合成是在通用的DNA自动合成仪(美国AppliedBiosystem公司381A型)上采用已知的亚磷酰胺法化学合成两条互补单链，单链1的序列为TCGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC，单链2的序列GTACATGCCACCGAAATACAGGCCTAGGACGCGGACGGACT，两片段退火后构成包括脑啡肽和连接肽的编码区的双链。各1微克的两条互补单链在以下条件退火pH＝7.5、室温和采用0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸退火缓冲液。
(ⅱ)干扰素基因的分离是采用冷冻匀浆及蛋白酶从中国人的胎肝中提取染色体DNA，再经苯酚和氯仿纯化后的DNA作为模板，再用常规通用的聚合酶链式反应扩增出人的干扰素-α1c基因，随后连接到通用的质粒pUC18中建成无性繁殖系。
(ⅲ)连接用限制性内切酶DdeI切割干扰素基因，产生Ddel粘端，与合成并经退火形成的双链的DdeI粘端在T4DNA连接酶催化下连接，最终构成编码融合蛋白的基因片段。将该基因片段再经T4DNA连接酶催化连接后组装入原核表达质粒pBV220中，经DNA测序证明与设计相符。
(ⅳ)表达由PRPL串联启动子控制在大肠杆菌中表达重组蛋白，其条件是，将含有表达质粒的大肠杆菌菌种接种到LB培养基，于37℃下振摇过夜，次日按1∶10体积比接种到新鲜LB培养基中，30℃下振摇至OD600＝0.6为止，转至42℃继续振摇4-6小时，即诱导表达出脑啡肽-干扰素融合蛋白。
(ⅴ)纯化将上述经诱导表达的菌液在一通用的微量离心机内以5000rpm离心10分钟，弃去上清液，向下层沉淀物加入1/100原菌液体积的7mol/L盐酸胍裂解液(pH8.0)，在4℃下静置过夜，次日于12000rpm离心10分钟，取出上层清液，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH＝7.5)进行透析，随后过抗干扰素单克隆抗体亲和层析柱，用甘氨酸缓冲液(pH＝2.5)洗脱，制得本发明的特异结合的脑啡肽-干扰素融合蛋白。
将本发明的抗肿瘤多肽药物脑啡肽-干扰素融合蛋白(1)经滤泡性口炎病毒-人羊膜传代细胞系统检测每升表达菌液(OD600＝1.0)的抗病毒活性，4次结果为9.8×10MU，7.0×10MU，8.5×10MU，7.5×10MU，平均为8.2×10MU，稍高于母体干扰素分子的抗病毒活性。
(2)采用H3-TdR掺入法测定抗肿瘤细胞增殖活性，结果如下表。
细胞系干扰素肿瘤细胞抑制率(%)浓度(U)脑啡肽干扰素单一干扰素P值结肠癌1014.23.8(HCT-8)10029.08.7<0.01100043.011.6多形胶质母细胞瘤1016.82.9(BT-325)10025.57.1<0.01100036.510.0(3)采用脑啡肽受体竞争剂Naloxone可阻断上述增强抑制的作用，证明本发明的融合蛋白的确由脑啡肽导向肿瘤细胞，而且上述效果与融合蛋白同脑啡肽受体的结合有关。
本发明的优点如下(1)本发明的脑啡肽-干扰素融合蛋白比单一的干扰素具有较高的肿瘤细胞抑制率，即抗肿瘤功效较佳。
(2)由于脑啡肽有把干扰素导向肿瘤细胞的功能，故对正常细胞损害较轻，即大大减轻了副作用，同时投剂量也较单一干扰素的量少得多。
权利要求
1.一种具有高效抗肿瘤功能的脑啡肽-干扰素融合蛋白，其特征在于氨基端的脑啡肽部分和羧基端的干扰素部分，两者由中间连接肽三肽(Ser-Gly-Ser)相连，总分子量为21KD。
2.一种具有高效抗肿瘤功能的脑啡肽-干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于(ⅰ)脑啡肽基因和连接肽基因的合成，是在通用的DNA自动合成仪上采用亚磷酰胺法化学合成，合成片段的结构设计为TCGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC，其中已包括脑啡肽和连接肽的编码区。(ⅱ)干扰素基因的分离，采用冷冻匀浆及蛋白酶从人的胎肝中提取染色体DNA作为模板进行聚合酶链式反应，扩增出人的干扰素基因。(ⅲ)连接用限制性内切酶DdeI切割干扰素基因，产生粘端，与合成基因部分由T4 DNA连接酶催化连接成融合基因。随后将融合基因经连接酶催化连接组装入原核表达质粒pBV220中，经DNA测序证明与设计相符。(ⅳ)表达融合基因在pBV220中由PRPL串联启动子控制在大肠杆菌中表达重组蛋白，即重组的脑啡肽-干扰素融合蛋白。(ⅴ)纯化经抗干扰素单克隆抗体亲和层析纯化。
全文摘要
一种新型、高效的抗肿瘤脑啡肽-干扰素融合蛋白，它是由氨基端的脑啡肽五肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干扰素部分，通过中间连接肽三肽(Ser-Gly-Ser)进行连接，总分子量为21kD。其中脑啡肽能将具有抗肿瘤功能的干扰素专一地导向肿瘤细胞，这样防止了干扰素损害正常细胞，故大大减轻了原有干扰素制剂的副作用，与单一干扰素相比具有更高的肿瘤细胞抑制率。
文档编号C12N15/19GK1076729SQ93100338
公开日1993年9月29日 申请日期1993年1月18日 优先权日1993年1月18日
发明者黎孟枫, 张沁, 曾庆, 侯云德, 张智清, 李玉英 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所