专利名称：编码氨甲酰磷酸合成酶ii的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的核苷酸序列，用重组DNA技术生产该酶的方法，以及该序列和酶在治疗学上的用途。
由于对传统药物具有抗性的人疟原虫、主要是恶性疟原虫的演化，目前迫切需要开发新的治疗疟疾的化学治疗剂。对疫苗进行研究似乎是非常馈赡艿奶娲椒ⅰ但是经过多年研究之后，到目前为止尚未有临床可接受的产品。而与此同时，抗蚊媒介昆虫的杀虫剂效力的下降却在增长。目前，多于三分之二的世界人口-约5亿人-被认为生活在疟区(Miller，1989)。在世界卫生组织(WHO)所列世界10种最流行疾病中它排在第8位(每年感染2亿7千万人口)，在10种最致命疾病中排在第9位，每年夺取2百万以上生命(Cox;1991;Marshall，1991)。尽管主要限于贫困国家，但是目前在美国(Marshall，1991)和澳大利亚(Johnson，1991)都有报道，而且旅行者疟疾病例不断增加(Steffen和Behrens，1992)。
疟原虫、恶性疟原虫及其宿主的比较生物化学研究表明许多代谢途径不同。这些区别之一就是该寄生虫仅仅依赖于嘧啶从头合成，因为它不能补救预先形成的嘧啶(Sherman，1979)。而且认为成熟的人血红细胞不需要嘧啶核苷酸(Gero和O′Sullivan，1990)。主要努力方向是开发嘧啶生物合成途径的抑制剂(Hammond等人，1985;Scott等人，1986;Prapunwattana等人，1988;Queen等人，1990;Krunhkrai等人，1992)，进一步证实该途径作为化学治疗位置的可能性。可以预期目前对关键嘧啶酶的分子生物学研究不仅可以作为更好地理解寄生虫生物化学的有效工具，也可以作为探察寄生虫与哺乳动物酶之间具体差异的有效工具。
谷氨酰胺依赖性氨甲酰磷酸合成酶(CSPⅡ，EC 6.3.5.5)催化真核生物的嘧啶从头生物合成途径的第一步定型和限速步骤(Jones，1980)。而且由于它催化涉及三个催化单元和七种底物及中间体这样一个复杂的反应，从生物化学观点来看它是一种非常值得研究的酶。CPSⅡ与其他嘧啶酶的结构关系随不同生物体而改变，这使其成为进行研究的一个好的主题。
可以从疟疾培养物得到的少量原料阻碍了分离足以进行分析量的纯蛋白质。而其固有的不稳定性更增加了纯化CPS的困难。用P.berghei(一种啮齿动物疟疾)粗提物进行研究显示了具有CPS活性的一种高分子量蛋白，据推测它与ATCase有关(Hill等人，1981)，这种状况也发现于酵母中(Makoff和Radford，1978)。然而，Krungkrai及其同事目前的分析(1990)测定了CPSⅡ和ATCase各自在P.berghai中的活性。尽管到目前的研究为止已经在恶性疟原虫中测得了CPS活性(Reyes等人，1982)，但是未指出其大小，也没有指出其在该途径中与其他酶键合。
CPSⅡ的谷氨酰胺依赖性活性可以分成两步(1)谷氨酰胺酶(GLNase)反应，使谷氨酰胺(G1n)水解并将氨转移至氨甲酰磷酸合成酶的位点;和(2)合成酶反应，在该反应中从两分子三磷酸腺苷(ATP)、碳酸氢盐和氨合成氨甲酰磷酸。第二种活性涉及三部分反应(a)碳酸氢盐被ATP活化;(b)活化的羧基磷酸与氨反应形成氨甲酸盐;和(c)氨甲酸盐的ATP依赖性磷酰化作用形成氨甲酰磷酸(Powers和Meister，1978)。因此，在CPSⅡ中有两个主要的区，谷氨酰胺的酰胺转移酶区(GAT)和氨甲酰磷酸合成酶区(CPS)或简单合成酶区。谷氨酰胺酶区(GLNase)是GAT的亚区，而在合成酶区中有两个ATP-结合亚区。
考虑到CPS谷氨酰胺的酰胺转移酶区与其他酰胺转移酶之间的相似性，已经提出这些亚单位由表示GLNase区的共同祖代基因(＝20 kDa)趋异进化而产生，而且CPS GAT区(＝42kDa，它包括仅存在于CPS中的推断结构区)的特殊进化一定包括其他序列的融合和/或插入(Werner等人，1985)。已经提出该哺乳动物CPSⅠ基因的GAT可以通过在该祖代基因的5′末端与未知基因的简单基因融合来形成(Nyunoya等人，1985)。
假定各种生物体较大合成酶区的基因进行了祖代激酶基因的基因复制，得到具有相应两半的多肽(Simmer等人，1990)。与大肠杆菌的亚单位结构和酵母的精氨酸特异性CPS不同，有人提出编码GAT和合成酶区的基因进一步融合形成了对高级真核生物嘧啶生物合成具有特异性的单基因。相反，Simmer及其同事(1990)提出精氨酸特异性CPS(象酵母中的cpa1和cpa2一样)以及大鼠线粒体CPSⅠ是由嘧啶嵌合体消融而产生的。
本发明人已经分离出了编码恶性疟原虫CPSⅡ酶(pfCPSⅡ)的完整基因，并确定了其特征。本文报道的是包括5′和3′未转译区的cDNA序列。如此，本发明人已经识别了各个谷氨酰胺酶和合成酶区。与酵母，D.discoideum和哺乳动物中的CPSⅡ基因不同，没有证据表明与随后的酶，精氨酸转氨甲酰酶(ATC ase)键合。这与Hill等人(1981)有关P.berghei酶的报告形成对照。然而本发明人已经发现了在天然恶性疟原虫基因中的两种大插入物，而这在从前未描述过。
因此，本发明第一方面在于编码恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的核酸分子，该核酸分子包括实质上如表1中1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或2071-3762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列，或功能等同序列。
在本发明优选的具体方案中，该核酸分子包括表1中1225-7695所示的序列或功能等同序列。
本发明第二方面在于分离的多肽，该多肽包括实质上如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的氨基酸序列。
本文所用术语“功能等同序列”是指该核酸序列中包括了少数变化，这种变化因密码简并所引起，而不会导致该序列编码不同的多肽。
本发明第三方面在于生产恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的方法，该方法包括在本发明第一方面的核酸序列能够表达的条件下培养用该核酸分子转化的细胞，并回收该表达的氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ。
该细胞可以是细菌或真核细胞。优选细胞的例子包括大肠杆菌、酵母和Dictyostelium discoideum。
正如本领域专业人员所容易理解的，阐明CPSⅡ的核苷酸序列使得产生一系列治疗剂成为可能。这些包括反义核苷酸、核糖酶以及用其他途径使RNA和DNA序列成为靶向，例如形成三联体。
正如可以从表1中所列序列看出的，该恶性疟原虫CPSⅡ基因包括在其他氨甲酰磷酸合成酶基因中未发现的两个插入序列。第一个插入序列分离出了推断结构区和谷氨酰胺酶区，而第二个插入序列分离出了两个该合成酶亚单位的ATP结合亚区CPSa和CPSb。
表1.恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ基因的核苷酸与推断的氨基酸序列
GAT区由两个亚区组成推断的结构区(1-750)和谷氨酰胺酶区(1447-2070)。这两个亚区被第一个插入序列(751-1446，有下划线的)分开。合成酶亚单位的两个ATP结合亚区CPSa(2071-3762)和CPSb(5572-7173)被第二个插入序列(3763-5571，有下划线的)分开。
由于在其他氨甲酰磷酸合成酶基因中未发现这些插入序列，因此它们代表治疗的主要目标，包括但不限于反义核苷酸、核糖酶和形成核苷酸的三联体，因为降低了与基因宿主同源染色体进行有害反应的可能性。
已知反义RNA分子适用于调节细胞内的基因表达。与部分CPSⅡ互补的反义RNA分子可以从CPSⅡ序列产生。这些反义分子可以用作检测是否细胞中存在CPSⅡ基因的诊断探针，也可以用作调节CPSⅡ基因表达的治疗剂。用CPSⅡ序列制备的反义核苷酸包括与CPSⅡ mRNA互补并能干扰其体内功能的核苷酸和含有恰好能在活细胞内转录以产生反义核苷酸的CPSⅡ序列成分的基因。该基因可以包括细胞、病毒、病原体信使mRNA(聚合酶Ⅱ)或结构RNA基因(聚合酶Ⅰ和Ⅲ)的启动子成分或合成启动子成分。在“基因调节反义RNA和DNA的生物学”(R.P.Erickson和J.G.Izant，Raven Press 1992)中回顾了反义设计。还可参见US5208149，其中包括有关反义核苷酸设计的更多例子。这些参考文献的说明书均引入本文作为参考。
本文所用术语“核苷酸”包括但不限于所有天然产生的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以及任何核苷酸类似物的寡聚物。核苷酸类似物包括所有能与另一个核苷酸形成序列特异性复合物(例如双链核酸分子或异源双链核酸分子)的化合物(包括甲基膦酸类或硫代磷酸类)，而且它可以具有有利的扩散或稳定性质。该核苷酸的定义包括通过磷酸二酯键、肽键或任何其他共价键连接的天然碱基或类似碱基。这些核苷酸可以通过在活细胞中活体内的任何结合来合成、体外酶促合成或化学合成。
适用于调节CPSⅡ基因表达的核糖酶包括具有专一性和催化区的CPSⅡ序列以促使CPSⅡmRNA体外或体内分裂的核苷酸。该催化区包括锤头、发夹、δ-病毒成分、核糖体RNA基因内区及其衍生物。有关核糖酶设计的更多资料可见于下列文献Haseloff，J.& Gerlach，W.L.(1988)Nature 334，585;Kruger，K，Grabowski，P.J，Zaug，A.J.Sands，J，Gottschling，D.E.& Cech，T.R(1982)Cell 31，147;国际专利申请WO 88/04300，US4987071和US5254678。这些参考文献的说明书均引入本文作为参考。该催化成分可以增强通过促进降解或一些其他机理进行的CPSⅡ靶mRNA的人工调节。
三螺旋寡核苷酸可以用于抑制从基因组转录。本文对CPSⅡ基因提出的给定序列将能够设计寡核苷酸，它们将形成三联体，因而抑制CPSⅡ基因的转录。有关适用于三联体形成的寡核苷酸产生的资料可见于Griffin等人的Science 245967_971(1989)，该参考文献的说明书引入本文作为参考。
三联体剂包括所有能够通过与DNA或染色质形成复合物与CPSⅡ基因结合的核苷酸。该相互反应可以实现三链Hoogsteen结构的形成或其他机理，例如依赖于CPSⅡ序列信息的链侵入。
因此，本发明第四方面在于能够分裂氨甲酰磷酸合成酶ⅡmRNA的核糖酶，该核糖酶包括从本发明第一方面的核酸分子得到的、与部分mRNA互补的序列。
在本发明此方面优选的具休方案中，该核糖酶包括从本发明第一方面的核酸分子的第一或第二种插入序列得到的、与mRNA互补的序列。
本发明的第五方面在于能够阻碍本发明第一方面的核酸分子表达的反义寡核苷酸。
如上所述，本发明一方面涉及通过重组技术生产CPSⅡ的方法。通过该方法产生的蛋白质和本发明的多肽适用于尝试体外药物结合研究，以开发其他的抗疟疗法。
为了更清楚地理解本发明的性质，将参照下列实施例和图对克隆恶性疟原虫CPSⅡ基因的方法进行说明。
实施例筛选基因(其中的氨基酸序列先前未检测出)的常规方法是通过异源探测，即使用密切相关生物体目的酶的基因片段。这已经被7位工作者用恶性疟原虫证明是不成功的，主要是因为其基因组的高A-T含量。经过用酵母ura2基因片段分离恶性疟原虫CPSⅡ基因的最初无效尝试之后(Souciet等人，1989)，本发明人选择了用聚合酶链反应(PCR)(Saiki等人，1988)放大部分CPSⅡ基因，以使用放大的产物作为筛选用探针。
本发明人使用从保存的CPS基因的氨基端GAT区和第一半合成酶区序列设计的寡核苷酸分离并克隆了PCR产物。核苷酸测序证实已经得到了部分CPSⅡ基因。用限制性酶使全部寄生虫DNA分裂，并用CPSⅡ特异性基因探针进行Southern分析。测定与基因探针杂交的DNA片段大小，然后用相应带的DNA构建“小文库”。用这种方法筛选pf CPSⅡ基因的较小克隆群。
为了分离全长pf CPSⅡ基因，使用已知序列的不同片段构建一系列小文库，以使用“基因巡察”获得该基因5′和3′末端的未知侧面区信息。所使用的策略总结于
图1中。
在首先的Southern分析中，用HindⅢ和EcoRI消化全部恶性疟原虫DNA，并用pfCPSⅡ 453bp PCR产物进行杂交。3.0kb HindⅢ和较小的EcoRI片段与该探针进行杂交。随后筛选HindⅢ pTZ18U小基因库导致含有3.0kb pfCPSⅡ基因片段CPS2的重组体分离。将453bp PCR产物定位于该片段的中间。
用CPS2的5′和3′末端的两个区分离每端邻近的序列，以得到更多的基因序列。CPS2的5′端HindⅢ/EcoRⅠ片段是分离进一步的1.5kb片段CPS1的工具，该CPS1由基因的全部5′区和一些非编码序列组成。
借助于CPS2 3′端的已知序列，得到550bp逆PCR(IPCR;Triglia等人，1988)产物。
该IPCR产物用于筛选3′区侧CPS2。通过小文库技术分离含有CPS3的3.3kb HindⅢ重组体和相关的3.3 kb XBaI克隆(未示于图1中)。使用CPS3 3′端的200kb XbaⅠ/HindⅢ片段进行1.3kb XbaⅠ片段CPS4的克隆，该CPS4含有推测的终止密码子和一些3′非编码区。
这四种基因片段(CPS1、CPS2、CPS3和CPS4)结合(除去其重叠部分)得到总共8 8kb的序列，它由约7.0kb的编码序列和1 8kb的侧面序列组成。
该恶性疟原虫CPSⅡ基因的完整核苷酸序列与其5′和3′侧面序列一起示于表1中。
对于本领域专业人员来说显而易见的是，由本发明人分离的该基因及其侧序展现了一系列治疗恶性疟原虫感染的新途径。本发明利用重组DNA技术能够产生一定量的恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ。该酶的特征使其能够用作化学治疗位点。
该基因的分离还使得能够产生反义分子，核糖酶或其他基因失活剂，它可用于防止寄生虫在感染个体中的增殖。
对于本领域专业人员显而易见的是，在不背离本发明广义描述的精神和范围条件下，对如具体实施方案所示的本发明可以进行各种改变和/或修改。因此，本发明的具体实施方案将被认为是对所有方面的说明，而非限制。
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权利要求
1.编码恶性疟原虫或其部分的氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的核酸分子，该核酸分子包括实质上如表1中残基1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或2071-3762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列或功能等同序列。
2.如权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子包括如表1中1225-7695所示序列或功能等同序列。
3.分离的多肽，该多肽包括实质上如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的氨基酸序列。
4.生产恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ或其部分的方法，该方法包括在权利要求1或权利要求2的核酸序列能够表达的条件下培养用该核酸分子转化的细胞，并回收该表达的氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ。
5.如权利要求1的方法，其中该细胞是大肠杆菌、酵母或Dictyostelium discoideum。
6.能够分裂氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ mRNA的核糖酶，该核糖酶包括从权利要求1或权利要求2所述的核酸分子得到的、与部分m RNA互补的序列。
7.如权利要求6所述的核糖酶，其中所述核糖酶包括从权利要求1或2所述的核酸分子的第一或第二个插入序列得到的、与部分mRNA互补的序列。
8.能够阻断如权利要求1或2所述的核酸分子表达的反义寡核苷酸。
9.多核苷酸结构，它在细胞中产生如权利要求6或7所述的核糖酶或权利要求8所述的反义寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供了编码恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II的核苷酸序列。氨甲酰磷酸合成酶II催化嘧啶从头生物合成途径的第一步定型和限速步骤。恶性疟原虫仅仅依赖于嘧啶从头生物合成，因为它不能补救嘧啶。而且认为成熟的人血红细胞不需要嘧啶核酸。因此，该酶代表主要的化学治疗位点。本发明涉及编码氨甲酰磷酸合成酶II的序列在重组制备氨甲酰磷酸合成酶II中的用途，还涉及由该序列设计的反义分子、核糖酶及其他基因失活剂。
文档编号C12R1/01GK1090327SQ9312169
公开日1994年8月3日 申请日期1993年12月3日 优先权日1992年12月3日
发明者托马斯·斯坦利·斯图尔特, 玛丽亚·维加·弗洛里斯, 威廉·詹姆斯·O·沙利文 申请人:友尼瑟驰有限公司