专利名称：人白细胞介素-6的制备方法及其产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人白细胞介素-6的制备方法及其产品。
许多病症所用的一些药物(如化疗药物等)可使人的免疫系统失调或降低免疫功能，使人的抵抗力下降，从而易引起细菌感染，引起其他病症，如果恢复或提高人的免疫功能，则就能提高人的抗病能力，人的免疫细胞和造血细胞的生长和分化受许多细胞因子的调控，白细胞介素就是上述这些细胞分泌的细胞因子，它们诱导淋巴细胞和造血干细胞的生长和分化，目前已发现有十几种白细胞介素，白细胞介素6具有抗癌作用，例如能抑制人类乳腺癌克隆的生长，白细胞介素-6具有造血功能，例如用IL-6处理的造血干细胞可恢复或强化造血系统的功能，从而在治疗败血症和血小板减少方面有着极其重要的作用，IL-6对于提高人体的免疫功能，抗病防病和进行术后、疾病愈后康复期的诊断和治疗具有重要意义和广阔的应用前景。
本发明目的是提供一种人白细胞介素-6的制备方法及其产品，该方法获得的多肽活性高。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案制备方法包括以下几个步骤
(1)血液中白细胞分离;
(2)白细胞总mRNA的分离按Pharmacia的微量mRNA纯化的试剂盒方法分离;
(3)人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入了BamHI位点，在合成的下游引物导入了EcoRI位点，并将天然IL-6的终止密码子TAG转换成大肠杆菌偏爱的终止密码子TAA，引物的序列为PL 5' CG GGATCC GC ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA 3'PR 5' CG GAATTC A TTA CAT TTG CCG AAG AG 3'(4)cDNA合成在含有人白细胞介素-6mRNA合成引物的存在下，利用逆转录酶的DNA合成系统，通过聚合酶链反应(PCR)扩增IL-6基因片段，其核苷酸序列为ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC10ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC ATG20TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC30CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA50TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT60 70
60 70TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT80GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTG CAG ATG AGT ACA90AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA100 110GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG120CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG130 140ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG150TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG160 164(5)IL-6cDNA克隆和大肠杆菌转化经EcoRI+BamHI酶切的pTrc载体和IL-6cDNA连接，该表达载体pTrc的启动子是-35(trpB)与-10(IacUV5)的杂合启动子;载有IL-6基因的质粒经培养获得阳性克隆的大肠杆菌。
(6)IL-6纯化、测定。
氢基酸序列为Met Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly10Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met20Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn30 40Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly50Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu60 70Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe80Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr90Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu100 110Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu120Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met130 140
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln150Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met End160 164以下结合实施例对本发明作详细说明(1)血液中白细胞分离取人血，以1∶1.5(V/V)的比例加入细胞分离液，在1000转/分下离心15分钟进行梯度分离，收集白细胞部分。
(2)白细胞总mRNA的分离按Pharmacia微量mRNA纯化试剂盒所述方法进行将含有107个细胞的白细胞悬液放在1.5ml塑料离心管中，1000rpm下，离心弃上清液，管中加入0.4ml提取缓冲液匀浆，再用0.8ml洗脱液稀释，10000xg下离心1分钟，得含有mRNA的匀浆清液。
另取一支1.5ml塑料离心管，加入1ml oligo(dt)-纤维素，1000xg下离心1分钟，除去贮存液。将匀浆清液加入到oligo(dT)-纤维素离心管中，混合3分钟，使mRNA亲合吸附，再在16000xg下离心10秒钟，弃上清液。
在管中加入1ml高盐缓冲液(10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，0.5MNaCL PH7.4)进行洗涤，将Oligo(dT)-纤维素悬浮，离心10秒钟，弃上清液。重复上述步骤4次。
在管中再加入1ml低盐缓冲液(10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，0.1MNacL，PH7.4)进行洗涤，重复洗涤3次。洗涤后的oligo(dT)-纤维素加入0.3ml低盐缓冲液悬浮，放入微型柱上，在柱中的oligo(dT)-纤维素再用0.5ml低盐缓冲液洗涤三次离心，除去洗涤液。加入0.2ml洗脱缓冲液(10mMTris-Hcl，1mMEDTA PH7.4)离心，洗脱下来的400μlmRNA溶液中加入10μl Glycogen溶液40μl乙酸钾溶液，再加入1ml-20℃冷乙醇(95%)，-20℃静置至少30分钟，在4℃离心5分钟得mRNA沉淀，沉淀在-80℃贮存，洗脱液在260nm的最大吸收是0.05，相当于RNA浓度为2μg/ml。
(3)cDNA的合成按Boehringer公司自Poly(A)RNA合成cDNA试制盒所述方法进行。20μlmRNA放于塑料离心管中，在冰溶中加入4μl第一链合成缓冲液，1μlRNase抑制剂，2μl dATP.dcTp.dGTP.dTTp混合液，2μloligo(dT)15引物，2μlAMV逆转录酶和适量重蒸水，总加入20μl，混匀后，在42℃予温60分钟，混合液再放入冰溶中。
再向混合液中加入第二链合成组分，包括40μl第二链合成缓冲液，1μlRNaseH溶液，5μl E.coli DNA聚合酶和适宜重蒸水，总体积100μl，混合后离心10秒钟，再于12℃予温60分钟22℃予温60分钟和65℃予温10分钟，再加入4μl T4 DNA聚合酶，于37℃予温10分钟，最后，加入10μl EDTA溶液(0.2mol/L)和2μl sarkosye溶液(10%W/V)终止反应，cDNA用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀而获得。
(4)PCR基因扩增在0.5ml无菌离心管中加入37μl重蒸水，5μl扩增缓冲液(0.5mol/L kcl，0.1mol/L Trise Hcl，15m mol/L Mgcl2，0.1%明胶，1%TriTonx-100.PH8.3).5μl dNTP混合液，5μl引物，1μl模板DNA溶液，混匀后离心10分钟，再放入95℃水浴中予变性10分钟离心10秒钟，然后加入1μl(3单位)Taq DNA聚合酶，混匀后加上50μl石蜡油，于72℃保温2分钟，再于93℃(1分钟)-50℃(1分钟)。-72℃(3分钟)循环35次，扩增样品，在琼脂糖凝胶电脉上回收IL-6cDNA扩增带。
(5)IL-6cDNA克隆和大肠杆菌转化经PCR法扩增的IL-6cDNA，经琼脂糖电脉回收，苯酚抽提，乙醇沉淀后，DNA再溶于15μl重蒸水中。
经EcoRI+Bam HI酶切的pTre载体和IL-6cDNA进行连接，连接后应在0.5ml塑料离心管中进行管中加入4.5μl重蒸水，1.5μl连接反应缓冲液(50mMol/L Tris-Hcl 10mMol/L Mgcl2，20mMol/L DTT.1mMOL/L ATP和50ug BSA，PH7.8)2μl载体DNA，6μl IL-6DNA片段和1μl T4 DNA连接酶，样品混匀后，在14-16℃水浴中保温24-72小时。
取5-7μl连接产物(载有IL-6基因的质粒)加入到100-200μl的E.coli HB101感受态细胞悬液中，混匀放在冰浴中30分钟再于42℃热击2分钟，加入1ml LB培养液(不含抗菌素)，37℃保温1小时，涂布于适当体积的LB固体培养基上(含有氨苄青霉素)，37℃培养过液，提取阳性克隆的大肠杆菌。
(6)IL-6产物鉴定经筛选后的大肠杆菌经三级培养，菌体裂解。去包含体再进行SDS-PAGE测定表明，IL-6蛋白占菌体蛋白的30%，IL-6纯化后可获得纯IL-6蛋白，蛋白分子量为18KD，纯化的IL-6的SDS-PAGE图谱见
图1。
实验中表达载体pTrc的启动子是-35(trpB)与-10(lacUV5)的杂合启动子，该启动子有很强的起始转录功能，Laco位点是Lac阻遇物结合位点，通过诱导物诱导可高效表达。Anti-Term是一段E.coli rrnB序列，可防过转录提前终止，其构象见图2，该表达载体市场有售。或依(Herman等Proc.Natl Acad Sci VSA 80∶21-25 1983)制备。
本发明优点本发明中采用了含有限制性内切酶切点的引物及特有的序列，经cDNA合成，其核苷酸序列为486个核苷酸，将获得的IL-6的cDNA克隆到质粒载体上，该表达载体pTrc的启动子是-35(trpB)与-10(lacUV5)的杂合启动子，以及其他特点使cDNA得到高效表达，该方法得到的产物(多肽)是162个氨基酸残基，依照Brakenhoff等工作，(J.Immunol.143∶1175-1182，1989)，在成熟IL-6的N末端缺失23个氨基酸时，其表达活性是全长成熟蛋白的2.8倍。
权利要求
1.一种人白细胞介素-6的制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤(1)血液中白细胞分离；(2)白细胞总mPNA的分离按Pharmacia的微量mRNA纯化的试剂盒方法分离；(3)人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入了BamHI位点，在合成的下游引物导入了EcoRI位点，其引物的序列为PL 5′ CG GGATCC GC ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA 3′PR 5′ CG GAATTC A TTA CAT TTG CCG AAG AG 3′(4)CDAN合成在含有人白细胞介素-6mRNA合成引物的存在下，利用逆转录酶的DNA合成系统，通过聚合酶链反应(PCR)扩增IL-6基因片段，其核苷酸序列为ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC10ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC ATG20TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC30CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA50TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT60 70TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT80GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTG CAG ATG AGT ACA90AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA100 110GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG120CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG130 140ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG150TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG160 164(5)IL-6cDNA克隆和大肠杆菌转化经EcoRI+BamHI酶切的pTrc载体和IL-6cDNA连接，该表达载体pTrc的启动子是-35(trpB)与-10(lacVW5)的杂合启动子；载有IL-6基因的质粒经培养获得阳性克隆的大肠杆菌。(6)IL-6纯化，测定。
2.按权利要求1所述的制备方法得到产物，其特征在于其氢基酸序列为Met Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly10Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met20Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn30 40Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly50Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu60 70Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe80Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr90Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu100 110Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu120Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met130 140Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln150Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met End160 16全文摘要
一种人白细胞介素-6的制备方法及其产物，方法包括人白细胞分离；白细胞总mRNA分离；人工合成含有限制性内切酶切点的引物；cDNA合成，其产物核苷酸序列全长为486个核苷酸，所获得的IL-6的cDNA克隆到质粒载体上，载体pFrc的启动子是-35(trpB)与-10(LacUv)的杂合启动子；经诱导高效表达后得高活性IL-6蛋白，它是162个氨基酸残基，其表达活性是全长成熟蛋白的2.8倍。
文档编号C12N15/24GK1110319SQ9410400
公开日1995年10月18日 申请日期1994年4月13日 优先权日1994年4月13日
发明者吴琼 申请人:张君宜