专利名称：重组△9脱氢酶以及编码该酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及能将连接到甘油脂上的一种饱和脂肪酸，硬脂酸转化为一种不饱和脂肪酸，油酸的重组△9脱氢酶，以及涉及编码该酶的离体基因。
蓝藻细菌的△9脱氢酶是一种将连接到甘油脂上的硬脂酸转化为油酸，以及将连接到甘油的C-1上的软脂酸转化为棕榈油酸的酶。
在蓝藻细菌中，已经证明脂肪酸的去饱和过程是通过在碳链的△9位点引入一个双键开始，接着在△12位上引入双键，随后在△6或△15位引入双键。△9脱氢酶是一种重要的酶，它与一系列去饱和反应的第一个步骤有关，并且与在硬脂酸或棕榈酸的碳链的△9位引入双键的反应有关，其中的碳链连接在甘油脂上。该反应需要依赖于铁氧还蛋白和NADPH的还原力。
另一方面，已有人报道将双键引入到没有结合甘油脂的硬脂酸的△9的酶，在动物细胞质中为硬脂酰CoA脱氢酶，在植物叶绿体中该酶是硬脂酰ACP(酰基-载体蛋白)脱氢酶。这些酶的DNA序列已得到测定。
蓝藻细菌的△9脱氢酶的特征在于将连接至甘油脂上的棕榈酸或硬脂酸转化为不饱和脂肪酸，而上文中提到的动物和植物中的两种△9脱氢酶不能催化该反应。为了鉴别该酶底物特异性的决定因子，应在分子水平上分析几种类型的蓝藻细菌△9脱氢酶。
生物膜的相转变温度取决于组成膜的极性脂类中不饱和脂肪酸的含量;因此，相转变温度随着未饱和脂肪酸含量的增加而降低。已经报道，在较低温度时蓝藻细菌中不饱和脂肪酸的量增加，暗示着细胞膜中脂肪酸的组分也与植物的低温忍受性有关。因此，可以认为脂肪酸脱氢酶的表达是受低温调节的。为了探讨调节表达的机理，需要分离相关基因。
鉴于上述理由，分离蓝藻细菌的△9脱氢酶基因是必需的，但是除了从异项圈蓝藻(Anabaena Variabilis)中分离外，尚没有分离该基因的其他报道。
为了分析蓝藻细菌的△9脱氢酶，本发明人已在分子水平上进行了广泛的研究，并且利用Synechocystis PCC 6803基因组文库分离到蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803△9脱氢酶的基因组DNA克隆。这步工作使本发明达到了目的。
因此，本发明的关键在于由序列表中的SEQ ID NO1表示的氨基酸序列代表的△9脱氢酶，以及编码该酶的离体基因。
下文中将对本发明进行详细描述。
在本发明中，蓝藻细菌(例如Synechocystis sp.PCC 6803)是光能自养型生长的，用玻璃珠破碎细胞，通过苯酚萃取和乙醇沉淀，提取基因组DNA。
用限制性酶(例如Sau 3A)部分消化完整的基因组DNA并且连接到噬菌体载体(例如λDASHⅡ)以产生基因组文库，该基因组文库通过噬菌斑杂交进行筛选，其中以蓝藻细菌异项圈藻的△9脱氢酶的编码区(下文中将它简略为des C(A)用作为探针。从阳性噬菌斑中提取噬菌体DNA。用限制酶消化后，使用des C(A)的0.75kb.p.DNA片段作为探针进行Southern杂交。采用二脱氧链终止方法对与探针DNA进行杂交的DNA片段进行序列分析。
得到的DNA片段的碱基序列以及由此推导出的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO1。
本发明还包括通过从显示于SEQ ID NO1的序列缺失，替代或迭加一个或多个氨基酸或核苷酸而得到的衍生物，条件是由该DNA片段编码的多肽的△9脱氢酶活性不受影响。
然后检查该合成的基因与del C(A)的同源性从而识别出该基因为△9脱氢酶基因族的一个新成员。该新基因在大肠杆菌中表达后可以测定△9脱氢酶的活性。通过提取用离体基因转化的大肠杆菌的膜，加入铁氧还蛋白，NADPH和硬脂酸，并且测定油酸的形成来分析△9脱氢酶活性。
Knoell和Knappe，Eur.J.Biochem.50，245-252(1974)报道了在大肠杆菌中存在铁氧还蛋白，一种电子供体。通过将该离体基因连接到大肠杆菌的表达载体上，用诱导能编码△9脱氢酶的DNA进行表达的载体转化大肠杆菌，并且检测产生的油酸，来证实酶活性。
例如将合成的△9脱氢酶基因导入到植物细胞中后可以与能在植物细胞中表达的一个启动子(如CaMV 35 s等)以及一个终止子(例如NOS等)相连接从而产生一个嵌合基因，然后将它连接至大肠杆菌质粒(例如pUC19，pBR 322等)上，扩增，并利用电击穿方法导入到一种植物细胞中。通过将该基因连接到农杆菌的Ti质粒或Ri质粒或通过利用这二种质粒作为二元载体，借助于农杆菌还可以将该基因转移到多种植物中。基因转化后可导致脂肪酸组分的变化以改善对低温的忍耐性。
本发明所述的蓝藻细菌的编码△9脱氢酶的基因可用于改善动物，植物和微生物的脂肪酸组分并且通过转化可用于制备能忍受低温的动物，植物或生物体。
下列实施例进一步阐明本发明，但本发明并不限制于这些实施例，这些实施例包括在本发明范围中。
实施例(1)Synechocystis PCC 6803基因组DNA的提取将300ml的Synechocystis PCC 6803(从巴斯德培养物收集中心获得)培养物(730nm处的吸光率为5至10之间)以4，500×g离心6分钟。收集1-2克细胞。向1克细胞中加入2ml碘化钠溶液(4克碘化钠/2ml蒸馏水)并且通过振荡悬浮。将悬浮液在37℃培养20分钟，并加入蒸馏水至终体积为40ml，将得到的溶液以10，000×g离心10分钟。将沉淀加到10ml的DNA萃取缓冲液(50mM Tris-HCL(PH8.5)，50mM氯化钠和5mM EDTA)和1.5ml的溶菌酶溶液(50mg/ml)中，并在37℃培养45分钟。向该混和物中加入1ml的10%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸，并且再保温20分钟，在此期间将破碎细胞溶液吸移几次以便减少溶液的粘性。向该破碎细胞溶液中加入3ml的溴化乙锭溶液(10mg/ml)，并且加入蒸馏水到最终重量为23克。向该溶液中加入21克氯化铯并将混合物以45，000×g离心20小时。通过与1-丁醇重复混和，从含有重新获得染色体DNA的溶液中除去溴化乙锭后，将染色体DNA溶液在4升无菌水中透析90分钟。透析后，用等体积的苯酚萃取得到的DNA，然后用等体积的氯仿萃取，并用乙醇沉淀。通过离心收集沉淀的DNA，再用70%乙醇洗涤，干燥，并溶于100μl缓冲溶液(10mM Tris-HCL(PH 7.5)/0.1mM EDTA)中。
(2)筛选Synechocystis PCC 6803基因组文库。
用限制性内切酶Sau 3A部分消化Synechocystis PCC 6803基因组DNA，并连接到噬菌体载体-λDASHⅡ的BamHI位点。在用大肠杆菌感染含有Synechocystis PCC 6803基因组DNA的噬菌体后，利用异项圈藻的des C基因的编码区的0.75kbDNA片段作为探针将2500噬菌斑进行噬菌斑杂交。从与探针杂交的噬菌斑中选出22个克隆并且提取噬菌体DNA。用HindⅢ消化Synechocystis PCC 6803的整个基因组DNA并且利用上文中描述的同样探针进行Southern杂交分析，最后检测到6.0kb谱带。在阳性克隆中，选出含有6.0kb HindⅢ片段再克隆到质粒模本Ⅱks(+)的HindⅢ位点。
(3)Synechocystis PCC 6803的△9脱氢酶基因(desC)的分离。
提取含有HindⅢ片段的质粒DNA，并利用限制性核酸内切酶Pst Ⅰ，Bam HI，EcoRI，SpeI和ApaⅠ制备该DNA的物理图谱。而且，用上述限制性核酸内切酶消化该质粒DNA并且利用含有在噬菌斑杂交中使用的desC基因的DNA片段作为探针以限定一个同源区而完成Sourthern杂交分析。
采用二脱氧链终止方法将该限定的区域进行测序从而找到了由975个碱基组成的蛋白质编码区(下文中简称为“ORF”)。该基因与异项圈藻的desC(A)有64%氨基酸同源。将各种蓝藻细菌的△12脱氢酶基因进行比较结果为，Synechocystis PCC 6803(Wada et al.Nature，347，200-203(1990))与异项圈藻(Sakamoto et al，Plant，Mol.Biol.24，643-650(1994))有59%同源，与Synechococcus Pcc 7002(Sakamoto et al.Plant.Mol.Biol.24，643-650(1994))有57%同源，上述情况表明在该分离到的ORF与异项圈藻的desC(A)之间有高度同源性。该ORF与大鼠及酵母的硬脂酰CoA脱氢酶分别有31%和30%同源性(大鼠Thiede et al.，J.Biol.Chem.261，13230-13235(1986);酵母Stukey et al.，J.Biol.Chem.，265，20144-20149)。从这些结果可得出结论，该分离到的ORF是Synechocystis PCC 6803的△9脱氢酶基因(desC)。Synechocystis PCC 6803 desC的碱基序列和由此推导出的氨基酸序列列于序列表中的SEQ ID NO1。
(4)构建表达载体以及在大肠杆菌中表达△9脱氢酶通过PCR扩增前面获得的含有desC的5＇-半区域的0.5kb片段并且连接到质粒模本Ⅱ(pBSⅡ)。将该DNA片段再克隆到含有desC编码区的3＇-半区域的质粒pBSⅡ/H6上得到合成质粒pBSⅡ/desC。用SpeⅠ消化pBSⅡ/desC并且将含有编码区的1.1kb DNA片断连接到pET 3a载体的NheⅠ位点，其中该DNA片段定位于T7噬菌体启动子的下游，得到pET 3a/desC质粒。为了进行比较，将pET3a/desC和不含desC基因的pET3a转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLYsS。将每个转化子培养于含有硬脂酸的LB培养基直到OD600为0.6。并且在有或无1mM IPTG时继续培养1小时。通过离心收集细胞，用1.2%NaCl溶液洗涤，并且通过离心再次收集。
(5)分析大肠杆菌单个脂类的脂肪酸组分采用Bligh和Dyer的方法(Can.J.Biochem.Physiol，37，911-917(1959))从收集到的大肠杆菌中提取脂类。采用在CHCL3/CH3OH/CH3COOH(65∶25∶10)展开的硅胶薄层层析法将提取到的脂类分离为PE(磷脂酰乙醇胺)，PG(磷脂酰甘油)和CL(心磷脂)的单个脂类。在分离之后，用小刀将含有单个脂类的硅胶刮下，在5%HCL/甲醇中85℃进行甲醇分解5.5小时。用2ml的正己烷萃取合成的甲酯，浓缩后，采用气相色谱法分离，测定单个脂类的含量(表1)。
在无硬脂酸的培养基中生长的大肠杆菌产生的所有脂类中的硬脂酸的浓度低于1%。而在含有硬脂酸的培养基中生长时硬脂酸浓度约10%。作为对照研究，在用pET3a转化的大肠杆菌中，IPTG诱导前和后，油酸量并不增加，在任何单脂类中其含量低于2%(表1)。另一方面，在用pET3a/desC转化的大肠杆菌中，由于IPTG的诱导作用，油酸的量与诱导前相比增加到2-3倍(6-10%)(表1)。棕榈酸，棕榈油酸16∶1(a)和异油酸18∶1(11)的量设有改变。
表1 将desC基因导入到大肠杆菌后在单个脂类中脂肪酸成分的改变脂种类 脂肪酸14:0 16:0 16:1(9) 18:0 18:1(9) 18:1(11)(mol%)诱导作用之前pET3aPE(78%) 2 31±2 25±1 14±2 t 25±1PG(21%) 1 27±2 17±1 16±1 1 36±1CL(1%) 1 32±1 14±1 19±2 2 32±2pET3a/decCPE(80%) 3±1 34±1 24±1 10±1 2 26±1PG(19%) 1 31±1 17±1 10±1 3±1 36±1CL(1%) 0 30±1 11±1 10±2 5±1 39±1IPTG诱导1小时pET3aPE(82%) 4±1 36±3 24±1 11±2 t 23±3PG(17%) 1 30±2 15±1 14±1 1 39±1CL(1%) 1 30±1 11±1 10±2 16±2 1 33±2pET3a/desCPE(74%) 3±1 33±1 24±1 9±1 6±1 24±1PG(21%) 1 30±1 19±1 8±1 10±1 31±1CL(5%) 1 27±1 18±1 8±1 10±1 36±1表中数值是从三种单独培养的培养物获得的。
t痕量(低于0.5%)(6)分析甘油主链的各个结合位点的脂肪酸成分采用上面描述的方法，从由IPTH诱导的大肠杆菌中提取脂肪酸，由硅胶薄层层析法分离PE和PG。使用德列马根霉的脂酶，根据Fischer等人的方法(Hoppe-Seyler's Z.physiol.CHem.354，1151-1123(1973))选择性地将它们水解。在甲醇分解后，采用气相色谱测定脂肪酸甲基酯的量。
在用pET3a转化大肠杆菌的对照试验中，无论在PE或PG情况下，在连接到甘油主链的C-1位脂肪酸中油酸的比例低于0.5%。另一方面，在用pET3a/desC转化的大肠杆菌中，分别在PE或PG的情况，在连接到甘油主链的C-1位的脂肪中油酸的比例分别增加到11%和18%(表2)。但是，连接在C-2位点时没有区别。棕榈酸，棕榈油酸和异油酸的比例没有改变。
上述这些结果表明，分离到的编码△9脱氢酶的基因将连接到磷酸脂的C-1位的硬脂酸转化为不饱和酸(不管是极性残基是与否)。
表2 在用desC基因转化的大肠杆菌细胞的单脂类中脂肪酸的位点分布脂种类 脂肪酸(位置) 14:0 16:0 16:1(9) 18:0 18:1(9) 18:1(11)(mol%)pET3aPE(C-1) 1 68 6 16 t 5(C-2) 3 4 42 6 1 41PG(C-1) 1 51 12 16 t 20(C-2) 1 8 18 11 3 58pET3a/desCPE(C-1) 1 61 7 9 11 11(C-2) 3 5 41 9 1 37PG(C-1) 1 51 16 1 18 14(C-2) 1 7 22 18 2 48
表中数值是从三个独自培养的培养物获得的。数值的偏差为小于2%。
t痕量(小于0.5%)参考实施例编码异项圈藻△9脱氢酶的基因的分离(1)基因组DNA的提取将300ml的异项圈藻菌株M-3(从Institute of AppliedMicrobiology University of Tokyo获得)培养物(在730nm处吸光度为5-10之间)以4，500×g离心6分钟。收集1-2克细胞。向1克细胞中加入2ml的碘化钠溶液(4克碘化钠/2ml蒸馏水)，并且振荡悬浮。将悬浮液在37℃保温20分钟，加入蒸馏水至终体积为40ml，将最后的溶液以10，000×g离心10分钟。将沉淀重新悬浮于10ml的DNA萃取缓冲液(50mM Tris-HCL(PH8.5)，50mM氯化钠和5mMEDTA)和5ml的溶菌酶溶液(50mg/ml)，并在37℃保温45分钟。向该混合物中加入1ml的10%(W/V)N-月桂酰肌氨酸，再保温20分钟，此期间将破碎细胞溶液吸移几次以便降低该溶液的粘滞度。向该破碎细胞溶液中加入3ml溴化乙锭溶液(10mg/ml)，加入蒸馏水到最终重量为23克。向该溶液中加入21克氯化铯，并将该混和物以45.000×g离心20小时。重复用正丁醇混和，从含有重新得到的染色体DNA的溶液中除去溴化乙锭之后，将该染色体DNA溶液在4升蒸馏水中透析90分钟。透析完成之后，用等体积苯酚，然后用等体积氯仿萃取得到的DNA，并用乙醇沉淀。通过离心收集沉淀的DNA并用70%乙醇洗涤，干燥，并溶于100μl的缓冲液(10mM Tris-HCL(PH7.5)/0.1mMEDTA)。
(2)分离异项圈藻的△12脱氢酶基因(desA)
用限制性内切酶Sau 3A部分地消化按上述方法得到的异项圈藻DNA，并连接到噬菌体载体-λDASHⅡ的BamHⅠ位点。将含有异项圈藻的基因组DNA的λ噬菌体感染大肠杆菌之后，利用含有Sycechocystis PCC 6803的△12脱氢酶基因(desA)的1.1kbHincⅡ-SpeⅠDNA片段作为探针对3.5×103噬菌斑进行噬菌斑杂交试验。随机地从与该探针杂交的噬菌斑中选出三个克隆。提取噬菌体DNA，用限制性核酸内切酶HincⅡ消化，利用上面描述的相同探针进行Southern杂交分析。在二个噬菌体DNA中，发现存在与该探针杂交的2.1kb谱带。对其中之一进行检查进一步鉴定出所述基因。
鉴定基因按如下所述进行用限制性核酸内切酶EcoRⅠ消化噬菌体DNA，并进行Southern杂交以证明一个7kb的片段与该探针同源。将该7kb片段连接到在大肠杆菌和synechococcus PCC7942之间穿梭的穿梭载体pUC303(Kuhlemier et al.，Plasmid 10.156-163(1983))的EcoRⅠ位点从而获得pUC303/7-kb。
由于Synechococcus PCC7942具有16∶0，16∶1，18∶0和18∶1的脂肪酸，但不具有16∶2和18∶1的脂肪酸。该菌株被认为缺失了△12脱氢酶基因。已有人报道，Synechococcus PCC 6803的desA基因导入到Synechococcus PCC 7943导致产生16∶2和18∶2的不饱和脂肪酸(Wada et al.，1990 ibid)。然后采用Williams & Szalay，Gene，24，37-51(1983)的方法用pUC303/7-kb转化Synechococcus PCC 7942。将PCC 7942培养于50ml的BG-11液体培养基中至浓度为5-8×107/ml，并以4，500×g于室温下离心10分钟。用BG-11培养基再次洗涤沉淀的细胞，通过离心收集，并重悬于BG-11培养基中至终浓度为1-2×109个细胞/ml。向该0.1ml的细胞悬浮液中加入0.1μg的DNA，在光照条件下缓慢振荡1小时。在含有10μg/ml的链霉素的BG-11琼脂培养基中，以1-5×107个细胞/平板的密度在黑暗中，30℃条件下将转化细胞生长16小时，进一步在光照条件下生长8小时。将0.5ml的1mg/ml链霉素滴加到琼脂培养基之后，选择出产生绿色信号的链霉素抗性转化细胞。
将转化体培养于100ml的BG-11培养基中，以4，500×g离心10分钟并冻干。将干燥细胞加到含有5%HCL(W/W)的10ml甲醇中，并在85℃加热2.5小时进行甲醇分解。用3ml的正己烷提取得到的脂肪酸甲酯三次。通过蒸发移走正己烷后，将该榈再溶解于0.1ml正己烷中。吸取该榈溶液的一份试样，通过气相色谱法分析该样品的脂肪酸甲酯组分。
Synechococcus PCC 7942野生型菌株不含有不饱和的18∶2脂肪酸，而用pUC303/7-kb转化的细胞产生的18∶2不饱和脂肪酸占总脂肪酸的1%，因此，可以得出结论，异项圈藻的desA基因存在于7-kbEcoRⅠ片段中。
用限制性核酸内切酶ClaⅠ，SpeⅠ和HindⅢ消化7-kbEcoRⅠ片段绘制物理图谱。而且，通过Sou thern杂交反应而鉴别与Synechocystis PCC 6803的desA同源的区域，并且采用双脱氧链终止方法进行测序。由于存在由1053个碱基组成的开放式阅读框架(ORF)并且特别提到在该ORF的氨基酸序列中是有与Synechocystis PCC 6803高度同源(大于80%)的三个区域，因此结论是该ORF是异项圈藻的desA基因。
(3)分离异项圈藻的△9脱氢酶基因(desC(A))对5＇上游异项圈藻desA基因的碱基序列进行测定结果表明在约1.2kb内存在由819个碱基组成的开放式阅读框架(ORF)。由于该ORF产物的氨基酸序列与大鼠和酵母的硬脂酰CoA脱氢酶分别有31%和29%的同源性。从而可得出结论该ORF是异项圈藻的△9脱氢酶基因(desC(A))。异项圈藻desC(A)的碱基序列以及由此推导出的氨基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO2中。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY，INCORPORATED MITSUBISHI CORPORATIONMITSUBISHI KASEI CORPORATION(ⅱ)发明名称重组△9脱氢酶和编码该酶的基因(ⅲ)序列数2(ⅳ)通讯的地址(A)地址TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY，INCORPORATED(B)街道7-1，Ichibancho 3-chome，Aoba-ku(C)城市Sendai(D)国家日本(E)邮编980(V)计算机可读形式
(A)存储盘类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentin Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅷ)代理人/代理机构资料(A)姓名(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度957(B)类型核酸(C)股数双(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅵ)原始来源(A)生物体Synechocystis PCC 6803(ⅸ)特征(A)姓名/关键词CDS
(B)位置1..954(C)识别方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1 (2)SEQ ID NO2的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度819(B)类型核酸(C)股数双(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅵ)原始来源(A)生物体异项圈藻(ⅸ)特征(A)姓名/关键词CDS(B)位置1..816(C)识别方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
权利要求
1.一种重组△9脱氢酶，其氨基酸序列描述于序列表的SEQ IDNO∶1。
2.一种编码权利要求1所述的△9脱氢酶的离体基因。
3.根据权利要求2所述基因，其碱基序列描述于序列表中的SEQ ID NO1。
4.能够表达由权利要求2或3所述基因编码的多肽的重组载体。
5.由权利要求4所述重组载体转化一种宿主细胞获得的转化子。
6.制备权利要求1所述重组△9脱氢酶的方法，该方法包括在一种培养基中培养如权利要求5所述的转化子并且回收表达产物。
全文摘要
本发明公开了一种编码蓝藻细菌△9脱氢酶的离体基因，含有该基因的表达载体，由该载体转化的转化体以及一种重组△9脱氢酶。其中所述基因通过转化可用于改善动物、植物和微生物中脂肪酸的组份，并且可用于制备能忍受低温的动物、植物或微生物。
文档编号C12N9/02GK1106456SQ9411788
公开日1995年8月9日 申请日期1994年9月22日 优先权日1993年9月22日
发明者村田纪夫 申请人:东北电力株式会社, 三菱商事株式会社, 三菱化学株式会社