专利名称：游霉素的回收的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从发酵液中回收游霉素的快速而廉价的方法。
背景技术：
游霉素(又称为匹马菌素或tenecetin)是一种广为人知的抗菌素(Florey，″Analytical Profiles of Drug Substances″，Vol.10，1981；Merck Index，8th ed，″Pimaricin″，p.834)。虽然人们已经认识到它的有价值的抗菌性质，由于极其高昂的生产费用，游霉素的研究及商业化几乎没有进行。因为游霉素溶解于各种液体，它的回收还没有达到经济可行。有必要开发一种经济可行的游霉素回收工艺。
游霉素已通过发酵法制备，例如英国专利846,933所公开的使用链霉素gilvosporeus。在这一工艺中，用甲醇萃取的方法回收游霉素，后续烦琐的吸附和洗脱步聚。Bridger的美国专利3,378,441号公开了通过盐析法将其从发酵液中分离、用甲醇萃取、除去固体然后蒸发液体来回收游霉素的工艺。Struyk的美国专利3,892,850号公开了通过用酸化甲醇萃取后蒸馏、沉淀的方法来回收游霉素的工艺。Struyk同时公开了用溶解于甲醇的氯化钙提高游霉素可溶性。每一种工艺都需要一个昂贵的回收步聚，如吸附和洗脱、蒸馏或蒸发。英国专利844,289号给出了用加水的方法从醋酸中沉淀游霉素的方法。Millis的PCT公报WO92/10580号，公开了从一种含有至少2g/L游霉素的发酵液中回收游霉素的工艺，包括加入甲醇和调节萃取介质的pH值至1.0-4.5以溶解沉淀下的游霉素；除去固体，并且将pH值升至6.0-9.0以沉淀游霉素。但是用该工艺回收的游霉素包含一种不希望得到的副产物--游霉素甲酯。
发明概述高纯度游霉素可以用甲醇在控制下的pH值和温度条件下萃取的方法，从一种含有游霉素的发酵液中回收。工艺包括步骤(1)将甲醇加入一股含有至少2g/L固体悬浮游霉素进料物流中，以形成一种萃取介质，并且维持萃取介质温度在0-25℃，优选不超过15℃；(2)在维持温度在0-25℃下的同时，调节萃取介质的pH值到1.0-4.5，保持0.5-30小时，但是温度为15-25℃时优选不超过0.5小时；(3)从萃取介质中除去固体以形成一种萃取液；(4)将萃取液的pH值升高至6.0-9.0；并且(5)回收沉淀的游霉素。
在另一项实施方案中，该工艺包括步骤(1)将里面含有约10-50g/L溶解度加强盐的甲醇，加入一股含有至少2g/L固体悬浮游霉素的游霉素进料物流中，以形成一种萃取介质；(2)从萃取介质中除去固体以形成一种萃取液；(3)将水加入萃取液中以沉淀游霉素；并且
(4)回收沉淀的游霉素。
在每种实施方案中，较高纯度游霉素可以经由下列方法得到(1)通过用水冲洗在最后一个步骤中回收的沉淀游霉素；(2)通过在游霉素沉淀前用活性炭处理萃取液；(3)上述步骤结合使用。优选的溶解度加强盐是氯化钙。
附图简述
图1是在控制的pH和温度条仵下回收工艺的示意图。
图2是采用溶解盐的回收工艺的示意图。
发明详述甲醇萃取游霉素发酵液的进料物流发酵法生产游霉素在Eisenschink的美国专利5,231,014号、英国专利846,933号和1991年8月5日提交的美国专利申请07/740,545和07/740,536号上已经公开。在这些发酵法中产生的发酵液包含固体悬浮游霉素、生物体和水。例如Eisenschink所公开的工艺产生的发酵液一般含有约7-12g/L游霉素。
发酵液用作回收工艺的进料物流，或者直接地或者通过除去一部分或几乎全部的水浓缩后使用。进料物流中至少应当含每升2g的游霉素，但优选更高的浓度。由于发酵液含水，固体悬浮游霉素和生物体固体，部分或基本上全部的水，可以用任何方便的常规固/液分高技术，例如离心、过滤或倾析来除去(参见实施例1，其中举以过滤实例说明)。如果需要，固体可以采用诸如热空气、喷雾干燥或用机械方法将水挤出等常规方法进一步干燥。如果固体用加热法干燥，应使用约20-80℃的温度。高于95℃的温度应当避免。
游霉素在萃取介质(进料物流与甲醇)中的溶解度随着水含量增加而降低。由于萃取介质中的水含量取决于进料物流中水的量，最好在第一步实施前尽可能多地除去水。如果进料物流中含大约70％体积的水，所需要的甲醇量是以非常干燥的进料物流开始时所需要的甲醇量的约3倍。如果进料物流中含大约40％体积的水，需要的甲醇是其约2倍。
进料物流中的固含量可以低至约20％(Wt)或更低，如果几乎不或根本不除去水，或者如果约98％(Wt)高含量的水被除去的话。为了达到高度回收所需的游霉素浓度，可能需要在甲醇加入之前浓缩发酵液。与设备情况有关，尤其是为了回收甲醇，在甲醇加入之前从发酵液中除去几乎所有的水可能是需要的。这样就将回收所需的甲醇量降至最低。如果经济考虑处主导地位，应当从发酵液中除去绝大部分水。这就使得回收过程可能在没有大量副产物生成的较高pH值下进行。在一个优选实施例中，除去水产生了含有至少50％(Wt)固体的进料物流。
甲醇的加入参照图1，在第1步中，甲醇被加入进料物流中。在合适的条件下，游霉素在这种廉价溶剂中有着优异的溶解性，而且甲醇的回收有简易的方法。为得到最优的游霉素回收率，加入足够的甲醇于进料物流中以得到含约20-150g/L游霉素的萃取介质。由于游霉素在高浓度下易于从酸化萃取介质中沉淀(第2步)，优选游霉素在萃取介质中的浓度为20-120g/L 。
酸的加入在第2步中，通过加入一种酸将萃取介质的pH值调节至约1.0-4.5。这使得游霉素在萃取介质中高度可溶。虽然任何常规可兼容的酸性物料都可以使用，但盐酸是一种优秀的选择。虽然不是一种优选技术，第1和第2步可以通过将酸直接加入甲醇的方法结合起来。
一种不希望得到的副产物游霉素甲酯的生成取决于pH值、游霉素-甲醇接触时间和温度(见表1)。保证这一步在约0-25℃的温度下进行很重要，因为这样可以将游霉素甲酯和其它不希望得到的副产物的生成降至最低。温度越高或接触时间越长，在给定的pH值下生成副产物的可能越多。为避免游霉素甲酯在15-25℃下生成，应采用短的接触时间，即0.5小时或更短。在约15℃，萃取时间不应超过1.5小时。优选的萃取温度为约0-15℃。
一般来讲，在pH值接近2以及约0℃下，萃取可以持续12小时而没有过量副产物生成。在约25℃下萃取可以在0.5小时后停止。当pH值增加至4.5，较长的时间是可以接受的。在pH值接近4以及温度在约4℃时，时间可以在30小时左右。
表1游霉素甲酯在甲酯中的生成温度 时间 游霉素甲酯(℃) pH(hr) (g/l)(％产品重量)232.4044 0232.4142 3.9232.4241 7.3232.4338 9.7233.2038 0233.2138 2.3233.2237 3.9233.2434 7.4233.2632 9.216 23 14234.0041 0234.0240 2.3234.0439 3.74 2.4042 0.44 2.4242 1.34 2.48.5 39 2.74 2.419 37 5.2
对于商业上可接受的生产，需要将甲酯含量维持在总产品(游霉素、甲酯和任何杂质)重量的约5％以下，优选低于其重量的约3％。
有可能通过冷却物流和/或甲醇的方法在所需的低温下进行甲醇萃取以使萃取介质在加入酸时在低温范围之内。
萃取进行的合适时间/温度/pH值的关系可以容易地通过试验确定，记下在一个特定pH值下产生所需产品纯度的时间和温度，并记住所使用的特定设备的最优的经济性。
pH值在某种程度上取决于萃取介质中的水含量和所希望的产率。为了达到约90％或更高的沉淀产率，游霉素在萃取介质中的浓度应当在约40g/L。在没有水存在的情况下，所需的pH值是约4.5。在约30％水/70％甲醇(体积)的情况下，所需的pH值是约2.5(表2)。
表2游霉素在甲醇及甲醇/水的混合物中的溶解度水含量 游霉素(％) pH (g/L)07.0604.55003.87802.09430 7.0430 3.31830 2.455
悬浮固体的除去在第3步中，剩余的悬浮固体可用任何方便的固/液分离技术除去，例如过滤或离心分离，留下一种萃取液。固体从萃取介质中除去后，仍然可能含有大量游霉素。因此，在一项优选实施方案中，用甲醇或甲醇与水的混合物冲洗固体，以回收至少一部分包含在固体中的游霉素。冲洗溶液加入萃取液中。
游霉素的沉淀和回收在第4步中，任何一种兼容的基本材料都可用于将萃取液的pH值提高至约6.0-9.0。这样就使得高纯度游霉素沉淀下来，然后被移出和干燥。典型的适用、廉价而且兼容的基本材料是钠和钾的氢氧化物。如果需要，也可以在第4步加入水以帮助游霉素沉淀。进料物流含有高浓度游霉素和少量水时，这样做可能更好。含有有用的游霉素、发酵残余物、甲醇、无机盐和水的剩余液体副产物(残余液)被送去回收甲醇。甲醇可以用溶剂回收的常规蒸馏方法进行。
本工艺生产的游霉素的重量纯度至少约80％，通常为至少约90％。在一项优选实施方案中，在第5步中回收的游霉素沉淀用水冲洗，然后干燥，得到纯度至少约90％重量的游霉素。
本工艺可以用间歇萃取法进行。但是对于大规模商业化萃取来说，连续过程可能更好。在一项技术中，游霉素发酵液，优选浓缩至低含水量，连续地加入混合器中并在低温下与甲醇彻底混合。pH值通过加入酸来控制，游霉素快速溶解。然后将得到的萃取介质加入过滤器中，以将生物体和其它固体从萃取液中分离出来。将萃取液加入一个在较高pH值下操作的结晶器中，游霉素就沉淀下来。沉淀游霉素和残余液被连续地从结晶器中移出。萃取时间、水含量、温度和pH值可以按游霉素生产的经济合理性加以调节。
加入溶解度加强盐不采用加酸降低pH值后加碱升高pH值并沉淀游霉素的方法，也可能快速得到游霉素的高回收率。在该工艺中，一种甲醇与溶解度加强盐的混合物，与游霉素发酵液进料物流(浓缩或非浓缩的)混合。得到的萃取介质被过滤以除去生物体和其它固体，得到一种萃取液。水被加入萃取液中沉淀游霉素。
任何在萃取条件下能增加游霉素在甲醇中的溶解度，并且不与游霉素萃取体系反应，或不干扰游霉素萃取、回收或产品纯度的盐，都可以使用。氯化钙(CaCl2)是优选的溶解度加强盐。盐在甲醇中的量为约10-50g/L时最为有效。
为了最优化游霉素的回收，如上所述，水一般要从进料物流中除去。进料物流应当含有足够多的游霉素，以便在萃取液(甲醇/盐溶液)加入进料物流后，得到的萃取介质含有至少2g/L的游霉素。游霉素浓度低于2g/L时，难以用加水的方法沉淀游霉素。
为了沉淀出高百分比的游霉素，萃取液中水的含量应当增加到至少50％(Vol.).表3给出了游霉素在甲醇/水/氯化钙溶液中的溶解度对水含量的函数变化。
表3游霉素在甲醇/CaCl2*中的溶解度在不同水浓度的萃取物水含量 游霉素(％.v/v) (g/L)0 9110 4420 1930640550220g/LCaCl2.
本工艺可以在pH2-9，优选pH6-8下进行。如果pH值低，萃取时间应当短，因为酸性环境促进了游霉素甲酯的生成(见表4)。如果pH值高于6，酯的生成减慢。任何合理的温度都可以采用(即20-30℃)。
表4酯在含40g/L CaCl2的甲醇中的生成温度 时间游霉素甲酯(℃)pH(hr)(g/L)(％产品)23 4.4 0 72 06 675.023 5.3 0 51 020 482.423 6.1 0 51 020 491.15 4.4 0 60 08 600.5图2概要地示意了本工艺。在步骤(a)，一种甲醇/盐溶液被加入进料物流中。在步骤(b)，残余悬浮固体用任何固/液分高技术，例如过滤或离心分离，从萃取介质中除去以得到一种萃取液。固体中可能仍含有大量游霉素，可以用甲醇或甲醇与水的混合物冲洗以回收至少一部分含在固体中的游霉素。甲醇冲洗溶液被加入萃取液中。在步骤(c)，水被加入萃取液以沉淀游霉素。在步骤(d)，沉淀的游霉素得以回收。回收的沉淀中至少含有80％重量的游霉素，通常至少含有90％重量的游霉素。较高纯度的产品，高达至少90％重量的游霉素，可以用在步骤(d)中用水冲洗回收的沉淀的方法，或在步骤(c)进行之前用活性炭处理萃取液的方法，或两种方法结合使用来得到。
工业应用本工艺是一种从发酵液，特别是从含有远高于2g/L含量游霉素的发酵液中，快速、廉价回收游霉素的工艺。
实施例1该实施例说明了在控制的pH值和温度条件下游霉素的回收。按照Eisenschink的美国专利第5,231,014号所叙述的方法制备的含有游霉素、生物体、水和少量营养物和杂质的发酵液，用在Buchner平底瓷漏斗中过滤的方法被浓缩至含约45％的固体。Celite545被加入其中以提高过滤率。滤饼中含约7.5％重量的游霉素。
大约74g滤饼与约96ml甲醇混合以生成一种萃取介质浆液，并将浆液温度用冰浴夹套降至约4℃。将盐酸加入浆液中降低pH值至约2.4，并在此温度和pH值下将浆液放置3小时左右。
用平底瓷漏斗过滤浆液，得到约150ml含约40g/L游霉素的清液(萃取液)。加入5N的氢氧化钠溶液，使萃取液的pH值升高至约7，并在此pH值下缓慢搅拌保持约1小时。在这期间，一种粘稠的白色沉淀形成。
用过滤法分离出沉淀，并在40℃左右真空干燥。得到大约4.1g干产品。产品含约92％重量的游霉素(干基)和1.7％重量的甲酯。
实施例2该实施例说明了在控制的pH值和温度条件下游霉素的回收。重复实施例1的过程，但萃取介质温度为约22℃而不是约4℃。干燥后得到3.9g左右的产品。产品含约83％重量的游霉素(干基)和10％重量的甲酯。
实施例3该实施例说明了采用溶解度加强盐来回收游霉素。用在平底瓷漏斗过滤使发酵液浓缩至含45％重量的固体。加入Celite545以提高过滤率。滤饼在一个流化床干燥器中，在60℃下进一步干燥至含98％重量的固体。干燥饼中游霉素的含量为18％(Wt)。
40g的干滤饼被加入3g氯化钙溶解于150ml甲醇的溶液中，浆液被混合30min。在平底瓷漏斗上过滤浆液并收集清滤液(萃取液)。
边搅拌边缓慢加入水，使滤液中水的体积含量增加至30％。一种粘稠灰白色沉淀形成。用过滤法分离沉淀，用水冲洗并在30℃下真空干燥。沉淀含88％重量的游霉素(干基)。
实施例4该实施例说明了采用溶解度加强盐来回收游霉素。发酵液(IL)被加热至70℃ 15min，冷却至室温并静置沉淀。500ml的上层液体被倾析弃去。用平底瓷漏斗过滤浓缩剩余固体。20gCelite545被加入以增加过滤率。用50ml甲醇冲洗滤饼两次，以除去大部分的水，并留下10％重量的水。滤饼含9％重量的游霉素。40g滤饼被加入2g氯化钙溶解在50ml甲醇的溶液中并混合0.5小时。用平底瓷漏斗过滤浆液并收集清滤液(萃取液)。将3g活性炭加入滤液并将混合物搅拌1小时。将炭过滤除去并收集清滤液。
缓慢地边搅拌边加入水，使滤液中水的体积含量增加到50％，一种粘稠的白色沉淀形成，将其过滤，用水冲洗并在30℃下真空干燥。沉淀含95％重量的游霉素(干基)。
权利要求
1.一种回收游霉素的工艺，包括按下列顺序的步骤(1)将甲醇加入一股含有固体游霉素的游霉素进料物流中，以形成每升含20-150g游霉素的萃取介质，并维持萃取介质的温度在0-25℃；(2)维持萃取介质的温度在0-25℃，并调节其pH值在1.0-4.5，0.5-30小时；(3)从萃取介质中除去固体以形成一种萃取液；(4)将萃取液的pH值提高至6.0-9.0；并且(5)回收沉淀游霉素。
2.权利要求1的工艺，其中进料物流中含有至少50％重量的固体。
3.权利要求1的工艺，其中萃取介质的温度维持在0-15℃。
4.权利要求1的工艺，其中通过在步骤(1)之前将酸加入甲醇中的方法，将步骤1和2结合起来。
5.权利要求1的工艺，另外包括在步骤(3)之后和步骤(4)之前(6)用甲醇冲洗固体并将甲醇加入萃取液。
6.权利要求1的工艺，另外包括在步骤(4)之前的步骤(7)用活性炭处理萃取液。
7.权利要求1的工艺，另外包括在步骤1之前的步骤(8)从游霉素进料物流中除去水，以使游霉素进料物流中含有少于10％重量的水。
8.权利要求7的工艺，其中萃取介质中含有每升20-150g的游霉素。
9.权利要求8的工艺，其中萃取介质的温度维持在0-15℃。
10.权利要求9的工艺，其中萃取介质的温度在0-15℃维持0.5-1.5小时。
11.权利要求10的工艺，另外包括在步骤(4)之前的步骤(7)用活性炭处理萃取液。
12.一种回收游霉素的工艺，包括按下列顺序的步骤(1)将含有约10-50g/L溶解度加强盐的甲醇，加入含有至少2g/L固体悬浮游霉素的游霉素进料物流中以形成一种萃取介质；(2)从萃取介质中除去固体以生成一种萃取液；(3)将水加入萃取液中以沉淀游霉素；并且(4)回收沉淀游霉素。
13.权利要求12的工艺，其中溶解度强化盐是氯化钙。
14.权利要求13的工艺，其中进料物流中含有至少50％重量的固体。
15.权利要求13的工艺，另外包括步骤(3)之前的步骤(7)用活性炭外理萃取液。
16.权利要求13的工艺，另外包括步骤(1)之前的步骤(6)从游霉素进料物流中除去水以便游离素进料物流中含有少于10％重量的水。
17.权利要求16的工艺，其中萃取介质中含有每升20-150g的游霉素。
18.权利要求17的工艺，另外包括在步骤(3)之前的步骤(7)用活性炭处理萃取液。
全文摘要
一项用甲醇萃取的方法从发酵液中回收高纯度游霉素的工艺在此公开。在一项实施方案中，该工艺包括下列步骤(1)将甲醇加入一股含有至少2g/L固体悬浮游霉素的游霉素进料物流中以形成一种萃取介质，并且维持萃取介质温度在0-25℃，优选不超过15℃；(2)调节萃取介质的pH值到1.0-4.5，并维持温度在0-25℃ 0.5-30小时，但是温度为15-25℃时优选不超过0.5小时；(3)从萃取介质中除去固体以形成一种萃取液；(4)将萃取液的pH值提高至6.0-9.0；并且(5)回收沉淀的游霉素。
文档编号C12P19/62GK1135239SQ94194150
公开日1996年11月6日 申请日期1994年9月16日 优先权日1993年9月17日
发明者P·T·奥尔森, J·R·米力斯, M·H·莱马 申请人:生物技术资源两合公司