用于植物体内基因表达的嵌合调节区和基因盒的制作方法

专利名称：用于植物体内基因表达的嵌合调节区和基因盒的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于调控植物体内基因表达的嵌合调节区。这些嵌合调节区来源于植物病原体根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefa-ciens)的冠瘿碱合成酶基因。
根癌土壤杆菌是一种革兰氏阴性土壤菌，它能感染大多数双子叶植物和某些单子叶植物。由根癌土壤杆菌引起的感染常会导致在被感染植物中形成冠瘿瘤。
在根癌土壤杆菌感染过程中，大的瘤诱导质粒(“Ti”)中一特定DNA片段(“T-DNA”)转移至易感植物细胞中并整合入细胞核基因组，由此使T-DNA表达。有些T-DNA基因编码涉及合成植物体内活性激素的酶。这些激素会在被感染植物中引起肿瘤。其它T-DNA基因指导合成与分泌特有的氨基酸和糖的衍生物，即冠瘿碱。根癌土壤杆菌可利用这些冠瘿碱作为碳源，并有时作为氮源。参见Gelvin，Plant Physiol.92281-85(1990)；Gelvin，TRANSGENICPLANTS(Academic Press 1993)；Ream，Ann.Rev.Phytopathol.27583-618(1989)；Zambryski，Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.43465-90(1992)。
T-DNA基因含有在植物环境中具有功能，并与植物调节区相似的区域。例如，大多数植物启动子含有诸如上游激活序列(“UAS”)的顺式作用元件(通常称为“增强子”)，它们通过与反式作用因子结合来确定或影响启动子的强度和组织特异性表达方式。参见Atchison，Annu.Rev.Cell Biol.4127-53(1988)。顺式作用元件的组合和空间取向以及可以与这些元件相互作用的核因子的存在会影响某一给定启动子的总体强度和它的表达方式。参见Dynan，Cell581-4(1989)。虽然T-DNA基因原先位于原核质粒上，但它具有在植物体内进行转录所需的全部序列元件(启动子和UAS)。例如，T-DNA基因具有确定转录起始位置的TATA盒序列，而且通常含有位于离转录起始位点100bp以上处的上游元件，这些元件调节转录水平。参见Gelvin，TRANSGENIC PLANTS(Academic Press1993)。
章鱼碱合成酶(ocs)和甘露碱合成酶(mas)基因是两种含有上游激活序列的T-DNA基因。ocs基因编码的产物将精氨酸和丙酮酸缩合成章鱼碱。参见Hack和Kemp，Plant Physiol.65949-55(1980)。位于ocs基因上游的一个16碱基对回文序列能在一瞬时表达系统中激活异源的玉米adh1启动子。参见Ellis等，EMBO J.611-16(1987)；Ellis等，EMBO J.63202-08(1987)。该回文序列也是激活已稳定转化的烟草愈伤组织中ocs启动子所必需的。参见Leisner和Gelvin，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 852553-57(1988)；Leisner和Gelvin，Plant Cell 1925-36(1989)。
mas1′和2′基因共有一个双重双向启动子和一个479bp的基因间隔区。这些基因编码用于两步法合成甘露碱的酶。参见Ellis等，Mol.Gen.Genet.195466-73(1984)；Komro等，Plant Mol.Bi-ol.4253-63(1985)。两个mas基因的转录呈背离式，基因间隔区包含了两种基因转录所需的全部顺式作用元件。参见DiRita和Gelvin，Mol.Gen.Genet.207233-41(1987)；Fox等，Plant Mol.Biol.20219-33(1992)；Leung等，Mol.Gen.Genet.230463-74(1991)；Guevara-Garcia等，Plant J.4495-505(1993)。
ocs和mas基因的启动子已被用于指导连锁基因在转基因植物中的表达。但是，这些启动子的应用由于在转基因植物某些组织中的弱表达水平而受到限制。参见DiRita和Gelvin，同上；Harpster等，Mol.Gen.Genet.212182-90(1988)；Sznger等，Plant Mol.Bi-ol.14433-43(1990)。例如，ocs启动子在转基因烟草中指导一种明显的细胞特异性的表达方式。参见Kononowicz等，Plant Cell 417-27(1992)。mas基因在叶和茎中呈现弱表达，但在根中的表现较强，并表现出一定程度的创伤和植物生长素诱导性。参见Langridge等，Proc.Nat′l Acad.Sci 867890-94(1989)；Teeri等，EMBOJ.，8343-50(1989)；Saito等，Planta 18440-46(1991)；Gue-vara-Garcia等，Loc.cit。
因为启动子和其它调节区表现出不同的强度和组织特异性，所以发展了某些重组调节区。例如，与某些反式作用因子特异性结合的增强子可调控转录活性和细胞特异性的表达方式。参见Bienz和Pelham，Cell 45753-60(1986)。
某些组成型启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S结构的使用也是已知的。CaMV 35S启动子含有活化剂，活化剂具有多个结构域，能功能性地以一种发展性和组织特异性的方式激活35S启动子。参见Benfey等，EMBO J.82195-2202(1989)；Benfey等，EMBOJ.91677-1684(1990)；Benfey等，EMBO J.91685-96。
Koziel等在Bio/Technology 11194-199(1993)中主要涉及在试图获得异源基因的组织特异性启动作用的一个启动子组套结构中所使用的启动子。Koziel给出了一种基因表达系统的结构，它具有一个与CaMV 35S启动子或与衍生自玉米的两种组织特异性启动子(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(“PEPC”)启动子和花粉特异性启动子)组合体连接的截短的cryIA(b)基因(该基因片段编码苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的一种1155个氨基酸杀虫蛋白的前648个氨基酸)。Koziel报导了两种启动子构型的高水平表达。Koziel等还使用了(1)已知引起绿色组织特异性表达的PEPC启动子和(2)玉米花粉特异性启动子。观察到的1500-4000ng/mg杀虫蛋白的表达是一种相当高水平的表达。另外，PEPC/花粉特异性启动子的使用产生了组织特异性表达。
有人还尝试利用其它技术进行重组表达。Bevan等在PCT/GB92/00566(1992)中主要涉及与Koziel等人的启动子不同的一种单个启动子的非组套性应用，以获取异源基因的组织特异性表达。该申请主要涉及利用菜豆苯丙氨酸氨裂解酶(“PAL”)启动子来产生组织特异性表达。将PAL基因组克隆(即除编码序列外，还含有作为PAL基因序列一部分的间插序列的克隆)的“假定转录调节区”、PAL蛋白氨基端68个氨基酸构成的开放式阅读框架(“ORF”)和完整的β-葡糖苷酸酶(“GUS”)ORF以及其后的胭脂碱合成酶的聚腺苷酸化和转录终止区(通常在大多数真核植物表达载体中将后两种元件融合以确保有效表达)融合构建一个杂交基因。这种最初的结构的确在某些植物中表现出较强的活性，研究者后来在杂交基因的PAL启动子区进行了一些删除。充分表达所必需的最短PAL启动子被发现是从PAL的转录起始位点起的253碱基对。研究者发现通过主要改变此最短区域内的缺失方式，可在一定程度上调节组织特异性表达。
美国专利No.5,034,322主要涉及胭脂碱合成酶启动子与一核酮糖-1，5-双-磷酸酯羧化酶小亚基基因的利用。
还报导道一种被称为“Mac”的嵌合启动子，它将+65至-301的mas区和-90至-941的35S增强子区结合，表现出数倍于转基因烟草植株中双倍CaMV 35S启动子的GUS活性。参见Comai等，Plant Mol.Biol.15373-81(1990)。
上述构建物在表达效率和调控性方面表现出了某些限制。例如，已有方法不能在需要时进行类似于组成型方式的强效表达。
发明概述本发明目的之一是提供改善植物体内基因表达的嵌合调节区。
本发明目的之二是提供由根癌土壤杆菌的启动子和上游激活序列构成的嵌合调节区。
本发明目的之三是提供含有在由根癌土壤杆菌的启动子和上游激活序列构成的嵌合调节区调控下进行表达的基因的基因盒。
本发明目的之四是提供外源基因在植物体内的诱导型表达。
本发明的另一目的是提供含有基因盒的质粒和转基因植物。
在实现上述及其它目的的过程中，根据本发明的一方面内容，提供了一种用于植物体内基因表达的嵌合调节区，其构成是将衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列与衍生自不同于第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的启动子进行可操作性地连接。第一和第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因最好是甘露碱合成酶基因或章鱼碱合成酶基因。
根据本发明的另一方面内容，提供了一种用于植物体内基因表达的嵌合调节区，其构成是将至少两种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶上游激活序列与一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶启动子可操作性地连接。上游激活序列可衍生自相同或不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因，例如甘露碱合成酶和章鱼碱合成酶。另外，上游激活序列之一或两者和启动子可衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
根据本发明的另一方面内容，提供了一种基因盒，它含有一个与前述嵌合调节区可操作性地连接的待表达基因。基因盒还可包括转录终止子和聚腺苷酸化信号，如胭脂碱合成酶聚腺苷酸化信号。
根据本发明的另一方面内容，提供了一种用于外源基因诱导型表达的基因盒，其中将一种外源基因与由衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子及衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的上游激活序列构成的调节区有操作性地连接。该调节区也可含有一段衍生自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的上游激活序列。
根据本发明的另一方面内容，提供了一种在植物体内进行基因表达的方法，包括将某一基因与本发明的嵌合调节区连接、将该基因和嵌合调节区插入植物体内以及允许在植物体内表达该基因等步骤。
根据本发明的另一方面内容，提供了一种含有本发明的嵌合调节区和基因盒的质粒和转基因植物。
本发明的其它目的、特征和优点将由本文中的论述、数据和图表而变得显而易见。
附图简述

图1表示了以mas和ocs为基础的嵌合调节区的结构。箭头所示为mas或ocs启动子的上游激活序列的取向。数字表示相对于转录起始位点的核苷酸位置。在结构3和4中使用了ocs上游激活序列的三聚体。在结构5和6中使用了ocs上游激活序列的单体或三聚体。
图2表示了烟草原初转化子提取液中以mas启动子为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性平均值由“x.”表示。A＝激活序列；P＝启动子；(Aocs)3＝ocs激活序列的三聚体。
图3表示了烟草原初转化子提取液中以mas启动子加上激活序列为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性的平均值由“x.”表示。A＝激活序列；P＝启动子；AocsAmasPmas＝ocs激活序列单体与mas激活序列加上启动子连接；(Aocs)3AmasPmas＝ocs激活序列的三聚体与mas激活序列加上启动子连接。
图4表示以烟草原初转化子提取液中以ocs启动子为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性平均值由“x.”表示。A＝激活序列；P＝启动子；Amas′＝mas区-213至-318；Amas″＝mas区-111至-318。
图5表示以烟草原初转化子提取液中以ocs启动子加上激活序列为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构GUS活性的平均值由“x.”表示。A＝激活序列；P＝启动子；Amas′＝mas区-213至-318；Amas″＝mas区-111至-318。
图6表示双倍35S和Mac启动子在几种转基因烟草植株的叶(双倍35SL、MacL)、茎(双倍35SS、Macs)和根(双倍35SR、MacR)中GUS活性表达的大致水平。
图7表示了用于诱导型表达研究的结构。“UAS”＝上游激活序列；“pmas”＝mas启动子；“GUS”＝β-葡糖苷酸酶基因；“NOS”＝胭脂碱合成酶聚腺苷酸信号序列。
图8表示纯化的成熟线虫卵中GUS活性水平。在pH5.5和7.5进行测定以检查细菌或动物的GUS活性。
图9表示各种转基因植物中线虫诱导的GUS活性。A块对应于具有Pmas启动子但无激活序列的转基因植物。B块对应于具有一个AmasPmas启动子的转基因植物。C块对应于具有一个Aoc-sAmasPmas启动子的转基因植物。
优选实施例的具体说明本发明涉及用于调控外源基因表达的嵌合型调节区，它由各种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列和启动子构成。外源基因包括欲在转基因植物中表达的任何DNA。本文中，不论何种来源的基因均被插入植物基因组中，所以插入位置对该植株来说是外源性的，即使该基因起源于被转化植株。1993年11月19日申请的美国申请No.08/155,067中也揭示了根据本发明的新结构，在此引作参考。
对本发明而言，任何类型的基因编码产物都可用于本发明中。在本发明的转基因植物中进行表达的外源基因包括但不限于β-葡糖苷酸酶；编码杀虫和杀真菌毒素的基因；病原体抗性化合物；超敏反应化合物，例如过氧化物酶、葡聚糖酶和几丁质酶以及植物抗毒素；杀虫剂、除草剂和杀真菌剂耐受性基因；植物酶，例如那些与蛋白质、淀粉、糖和脂肪成分有关的酶；植物酶抑制剂，如蛋白酶和淀粉酶抑制剂；植物激素；昆虫激素和信息素；药物和营养化合物，如β-胡萝卜素；维生素和抗体，包括抗体的片段和单链衍生物；干扰植物体内现有核苷酸序列的反义转录产物。参见Kung和Wu，TRANS-GENIC PLANTS，Vol.1(Academic Press 1993)。
通常，天然的甘露碱启动子加上激活序列，或天然的章鱼碱启动子加上激活序列在转基因烟草植株组织中强度较弱(连锁的gusA报道基因产生的GUS活性为几百至几千GUS活性单位)。根据本发明内容，将来自这些基因的UAS组套地连在一个启动子加激活序列前显著提高由连锁的gusA报道基因产生的GUS活性至两个数量级，由此产生的活性高达几十万GUS活性单位。对这些表达新启动子-gusA融合基因的转基因烟草植株的组织进行的组织化学检查显示，这种新的启动子和激活序列组合体可在多数类型的植物细胞中发挥作用。所以，这些组合体(嵌合调节区)可能比本领域已知的启动子具有大得多的组成型。
本发明涉及可强效、连续启动基因表达的改良型植物调节区。另外，还可获得组织非特异性和/或组织增强性的表达。根据本发明选择激活序列和启动子将得到期望的表达类型。
新嵌合调节区在烟草中表现出强于任何其它已知调节区的表达特性。烟草可能是植物转化的常用模型。而且，新调节区可以几乎是组成型的(始终处于启动状态)，因而在许多植物组织中，它比现有技术中的调节区更具有利用潜能。
本发明涉及用于植物体内基因表达的嵌合调节区，它可以具有衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活序列，该序列与衍生自第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段启动子序列或与衍生自第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活和启动子序列可操作性地连接。
本发明的嵌合调节区可与外源基因可操作性地连接，再与一个植物功能性终止子可操作性地连接，然后再与一段植物功能性聚腺苷酸信号序列可操作性地连接。本发明内容之一的嵌合调节区在许多时候将是高度组成型的。
上游激活序列是天然状态下通常位于天然转录起始位点前至少100碱基对的序列，它能对表达产生影响。在这方面，章鱼碱和甘露碱合成酶基因的UAS特别有用。这些UAS可以与启动子序列或上游激活序列和衍生自不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的启动子序列可操作性地连接。
“衍生”一词用于有关启动子及上游激活序列等DNA区域的论述中时，指“衍生”DNA区域来自某种天然存在的DNA区域或其它来源的DNA区域或以其为基础。“衍生”DNA区域可以与天然存在的DNA区域或其它来源的DNA区域有所不同(通常是通过人工诱变)。
“可操作性地连接”指第一序列与第二序列足够靠近，从而可使第一序列对第二序列或对受第二序列调控的某一区域产生影响。例如，一个UAS可与一个启动子可操作性地连接，UAS可由此增强启动子的转录强度。此时，UAS通常位于启动子的5′端。然后，UAS和启动子可以再与某一基因或操作性地连接，从而使该基因在通常位于其5′端的UAS/启动子组合体的调控下得以表达。通常，启动子距转录起始位点30-50碱基对内，距翻译起始位点几百碱基对内。激活序列通常距启动子几百碱基对内。例如，多数激活序列距被增强的启动子约300至400碱基对内。在使用了一个以上激活序列的本发明实施例中，激活序列彼此间距在100至200碱基对内。
用于构建本发明嵌合调节区的源冠瘿碱合成酶基因可以互不相同，而且最好选自由甘露碱、章鱼碱、胭脂碱和农杆碱合成酶基因组成的冠瘿碱合成酶基因。
由天然mas和ocs启动子加激活序列指导的GUS活性的表达局限于特定的细胞类型。与天然结构相比，将一段ocs激活序列与mas启动子加激活序列可操作性地连接，以及将一段mas激活序列与ocs启动子加激活序列可操作性地连接表现出了可调控表达方式。所以，根据本发明的另一方面内容，可在包括木质部导管细胞和叶表皮细胞在内的许多细胞类型中获得GUS及其它基因的表达。另外，根据本发明的另一方面内容，也可以获得限定方式的表达。一个ocs UAS和一个mas最短启动子可操作性地连接而成的嵌合调节区在叶维管组织中产生弱表达，而在韧皮部组织中产生强表达。
本发明还涉及编码一种外源多肽的重组基因盒。重组基因盒可含有衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活序列和衍生自与之不同的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段启动子序列或上游激活序列加启动子序列，上述序列均与一外源基因可操作性地连接。该结构中的外源基因可与一段植物功能性终止子序列和/或一段植物功能性聚腺苷酸信号序列可操作性地连接，从而使终止子序列和聚腺苷酸信号序列可对该基因或该基因的转录产物产生影响。终止子序列和聚腺苷酸信号序列位于基因的3′端。
本发明的另一方面内容涉及可通过创伤或害虫感染诱导的启动子和上游激活序列组合体(调节区)。开发出的一种组合体(AmasP-mas)在根组织中表达良好并可被病原体进攻所诱导，而另一种(AocsAmasPmas)表达更广泛，但可被害虫进攻所诱导。这些表达系统将可用于针对根害虫，如线虫或真菌的基因，并将被用于抵抗昆虫类害虫和叶病原体。例如，编码干扰线虫繁殖循环的杀线虫毒素和蛋白的基因可与本发明联用。
病原体侵染可诱导如上所述的使用了甘露碱合成酶和mas或ocs激活序列的调节区。Keen在Plant Molec.Biol.19109-22(1992)中描述了多种用于抗病原体的基因。
根据已有的序列信息可方便地制得冠瘿碱合成酶基因的启动子和上游激活序列等转录元件。例如Leisner等在Proc.Nat′l Acad.Sci USA 852553-57(1988)、Leisner等在Plant Cell 1925-36(1989)中揭示了章鱼碱合成酶基因的转录元件。DiRita和Gelvin(同上)、Fox等在Plant Molec.Biol.20219-33(1992)、Leung等在Mol.Gen.Genet.230463-74(1991)、Langridge等在Proc.Nat′l Acad.Sci USA 863219-23(1989)中揭示了甘露碱合成酶基因的转录元件。Ha等在Nucl.Acids Res.17215-23(1989)、Mi-tra等在Mol.Gen.Genet.215294-99(1989)、Ebert等在Proc.Nat′l Acad.Sci USA 845745-49(1987)、An等在Mol.Gen.Genet.203245-50(1986)中揭示了胭脂碱合成酶基因的转录元件。Bandyopadhyay等在J.Biol.Chem.26419399-406(1989)中揭示了农杆碱合成酶基因的转录调控元件。另外，Barker等在PlantMolec.Biol.2335-50(1983)中揭示了一种T-DNA的全部序列。
根据本文中的说明可获得不同的表达水平和方式。利用标记系统，如在此描述的gusA可评价以某一给定实施方法获得的表达量和方式。以下实施例将进一步解释本发明。这些实施例是对本发明的说明，绝不是限定本发明。实施例1一段ocs或mas上游激活序列与一段mas或ocs启动子和激活序列的结合强效地提高了GUS的表达如图1所示，创建新的mas和ocs启动子和上游激活序列的组合体。对mas UAS的多个亚结构域进行了测试，因为过去的缺失试验已表明转录起始位点上游138碱基内的序列足以准确启动向日葵冠瘿瘤组织中mas2′/nptII融合基因的转录。但是，-138至-318之间的序列也可能与mas2′启动子活性的定量调控有关。参见DiRi-ta和Gelvin，Mol.Gen.Genet.207233-41(1987)。被测试的masUAS是i)UAS＝-318至-138；ii)UAS′＝-318至-213；iii)UAS″＝-318至-111。参见图1。
利用自转录起始位点起在-318和-138碱基对处缺失的两种mas启动子构建第一组嵌合调节区并将其作为转录融合体与uidA(gusA)粘接(图1中的结构1-6)。第一类嵌合调节区在-138处缺失的mas启动子上游含有(两种取向)ocs激活序列(-116至-333)单体或三聚体(图1中的结构3和4)。第二类嵌合调节区在-318处缺失的mas启动子上游含有相似的ocs激活序列单体或三聚体(图1中的结构5和6)。该ocs区含有一个16碱基对的回文序列及5′和3′的调控序列，当它们稳定地整合入植物基因组后，对在烟草愈伤组织和植株中激活ocs启动子是十分重要的。参见Leisner和Gelvin，1998和1989(同上)；Kononowicz等，Plant Cell 417-27(1992)。
利用转录起始位点起在-333和-116处的两种ocs缺失体构建作为uidA基因的翻译融合体的第二组嵌合调节区(图1中的结构8-16)。创建了两种mas上游激活序列。图1中结构9-12使用了含-213至-318序列的短mas区。图1中结构13-16使用了含-111至-318序列的长mas区。短或长mas区被加在两种ocs缺失体的上游。
如下制备嵌合结构。所有结构的基础是Clontech公司的二元载体pBI101.2。而质粒pBI101.2的基础是复制子pRK290。质粒pBI101.2含有T-DNA边缘序列、在植物体中用卡那霉素选择的nos-nptII嵌合基因和一个跟有聚腺苷酸信号序列的不带启动子的GUS基因。从pKan2-138的一个EcoRV-XbaI片段制得mas启动子，其中含有与转录起始位点有关的-138至+65区(20128至20343碱基对)。参见Barker等，Plant Mol.Biol.2335-50(1983)；DiRita和Gelvin，同上。先将取自pKan2-318的mas激活序列和启动子序列区即与转录起始位点有关的-318至+65区(20128至20513碱基对)克隆入CUp31(pUC13的衍生体，具有pUC13骨架但含有一个由5′向3′读作HindIII、PstI、SstI、SmaI、BamH1、XbaI的多接头)的SmaI-XbaI位置。再将所得的CUp31的HindIII-XbaI限制性核酸内切酶解片段克隆入pBI101.2多接头的HindIII-XbaI位置，由此得到质粒pNi1和pNi2(分别对应于结构1和2)。
由质粒pENΔ1(Leisner和Gelvin(1988)，同上)制取一个带HindIII接头的ocs增强子片段。该片段位于转录起始位点-333至-116(13774至13991碱基对，Barker等，同上)，将其三聚体以两种取向克隆入pNi1中mas上游的HindIII位置，由此得到图1中结构3和4。为了创建结构5和6，将相同的ocs激活序列片段的三聚体或单体克隆入pNi2中mas激活序列加启动子上游的HindIII位置。
将取自pEN1(Leisner和Gelvin，同上)的含ocs启动子区和部分ocs结构基因的一个BamHI-EcoRI片段即转录起始位点起-116至+296(13774至13362碱基对)和含ocs激活序列和启动子区的XbaI-EcoRI片段即转录起始位点起-333至+296(13991至13362碱基对)分别克隆入pBluescriptII SK+(Stratagene公司)的BamHI-EcoRI和XbaI-EcoRI位置。再将由所得的pBluescript衍生体制得的XbaI-EcoRI片段克隆入pBI101.2的XbaI-SmaI位置，由此创建质粒pLH3(结构7)和质粒pNi3(结构8)中的GUS翻译融合体。将来自pKan2-318的含有一段“短”mas激活序列即转录起始位点起-318至-213(20513至20407碱基对)的XhoI-HaeIII片段克隆入pUX31(pUC13的衍生体，具有pUC13的骨架但其中的SamI位点被换成XhoI位点)的XhoI-HincII位置。用Klenow片段将所得的XhoI-HindIII片段制成平端，加上XbaI接头，将片段以两种取向克隆在pLH31(创建结构9和10)和pNi3(创建结构11和12)的XbaI位置。同样，利用Klenow片段将取自pKan2-318的一个长XhoI-MnlI mas激活序列片段即转录起始位点起-318至-111(20513至20305碱基对)制成平端，加上XbaI接头后将片段以两种取向克隆在pLH31(创建结构13和14)和pNi3(创建结构15和16)的XbaI位置。
然后将上述每一种结构转化至大肠杆菌DH52中，于37℃生长在含卡那霉素的LB培养基中。由限制性酶切图谱确定插入取向。含800bp HindIII-BamHI片段和CaMV 35S启动子的质粒pBI121(Clontech公司)被用作比较嵌合调节区相对强度的参照物。
利用含迁移质粒pRK2013的E.coli MM294，通过三亲株接合过程将带有插入子的重组质粒迁移入(A.tumefaciens LBA4404。参见Hoekema等，Nature 303179-80(1993)；Ditta等，Proc.Nat′l Acad.Sci.777347-51(1980)。在LBA4404中，重组质粒保留作为独立的复制子(“二元载体”)，该质粒可转移入植物体，然后整合到植物体的细胞核DNA中。也可使用其它方法，如电穿孔来用将质粒转化入根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)细胞。
在含0.5％葡萄糖、10μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的AB基本培养基平板上选择根癌土壤杆菌转接合体。参见Lichtenstein和Draper，DNA CLONINGA PRACTICAL APPROACH(Glover编辑，Oxford-IRL Press 1986)。由DNA斑点分析确定受体A.tumefaciens菌株中迁移质粒的导入。
利用叶片转化法通过含有这些结构的A.tumefaciens菌株转化取自红花烟草(Nicotiana tabacum)Wisconsin 38变种的6周大的不结果枝尖培养物的叶片。参见Horsch等，Science 2271229-31(1985)。被感染叶片在不含抗生素的MS3+培养基上生长3天。然后将叶片转移到新鲜的含1250mg/l羧苄青霉素和200mg/l卡那霉素的枝诱导性培养基中。参见Kononowicz等，Plant Cell 417-27(1992)。4至5周后，由每一叶片长出的单个枝条被转移到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l卡那霉素的根诱导性培养基中。2周后，将枝尖转移到含50mg/l卡那霉素的BGS培养基(含1mg/l叶酸、10mg/l吲哚乙酸和30mg/l激动素的MS培养基)中以体外保持每一系的枝尖培养物。
检查含有各种结构的再生转基因植株的GUS活性。当植株长到10至12叶阶段时，由第4或第5片已充分舒展的叶及附近的茎和生长活跃的新生根收获少量的烟草组织。在200μl提取缓冲液中将组织磨碎并于-70℃保存。参见Jefferson和Wilson，PLANTMOLECULAR BIOLOGY(Gelvin & Schilperoot编辑，Kluwer A-cad.Press 1991)。使用10μl提取液(约20至30μg蛋白质)，以MUG(4-甲基散酮酰基-β-D-葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide))为底物，根据Jefferson和Wilson的方法测定GUS活性。蛋白质浓度是根据Patterson，Analyt.Biochem.83346-56(1977)测定的。
含有相同结构的单个转基因植株表现出一系列不同的GUS活性(见附图2-5)。但是，通过测定大量含相同结构植株中的GUS活性，可估计每一种嵌合调节区的相对强度。因为未能测出使用激活序列元件以相反方向克隆的结构在GUS范围上的区别，所以将每一种双成员结构小组的数据合并(3和4、5和6、9和10、11和12、13和14、15和16)。
在所有被检组织中，由mas-138缺失体指导的表达产生GUS活性的最小基础水平(图2，结构1)。最短mas启动子加上天然mas激活序列产生结构2，它在叶和茎组织中指导平均值约为1000单位的低水平GUS活性(附图2，图表A和B)。在根组织中可观察到该结构较强的GUS活性，平均值约为12,000单位(附图2，图C)。如上所述，这些结果表明该mas启动子加激活序列区造成了mas2′启动子的根中优先性表达。以异源ocs激活序列(三聚体)在mas-138缺失体的上游替换mas激活序列(结构3和4)基本不改变叶和茎中与同源mas启动子和激活序列复合体相比的GUS活性水平(附图2，图A和B)。综合数据表明，ocs激活序列加启动子的表达在根中并不比在茎中有显著提高(见下文，结构8)，这些数据提示mas启动子的根中优先性表达缘于由转录起始位点138bp内的某一元件。ocs激活序列或mas激活序列都可以进一步增强这种组织特异性表达方式的表达量。
在mas启动子区的-66位鉴定出一个AS-1串联重复基序(Lam等，Proc.Nat′l Acad.Sci USA 867890-94(1989))的同系物。当该元件在CaMV 355中被发现时，其可与反式作用因子ASF-1相互作用(Lam等，Ioc.cit.)并据说可指导根中高活性的组织特异性表达方式(Benfey等，同上)。
将由嵌合结构指导产生的GUS活性与由CaMV 35S启动子(pBI121的-800)获得的活性比较。多数35S-GUS转化子表现出相似或低于含mas激活序列和启动子结构植株的GUS活性(附图2)。如Lam等(同上)所报道的，观察到了35S启动子的根中优先性表达。
结果显示，ocs和mas启动子含有指导组织特异性转录的顺式作用元件。参见Kononowicz等，Plant Cell 417-27(1992)；Leung等，Mol.Gen.Genet.230463-74(1991)。根据这些结果，测定异源激活序列复合体是否能改变由ocs或mas启动子单独指导的表达方式，从而在特定的植物组织中引起被增强或被减弱的启动子活性。为测试该假定，将附图1中所示的结构5和6(在mas激活序列和启动子的上游有一个ocs激活序列三聚体或单体)引入烟草并测定不同组织中的GUS活性(见附图3)。与mas2′启动子和激活序列相比，含一个ocs激活序列单体的新嵌合区提高了叶(6.6倍)、茎(3.0倍)和根(3.4倍)中GUS活性的表达(见附图2和附图3)。与缺少附加的ocs激活序列的mas2′启动子和激活序列(图1和2中的结构2)相比，含一个ocs激活序列三聚体的结构极大地提高了叶(22倍)、茎(1.7倍)和根(9倍)中GUS活性的表达。这些结果表明，至少在叶和茎组织中，加上多拷贝的ocs激活序列对mas2′启动子和激活序列的相对活性有惊人的强效扩增效应。
试验表明，在转基因植物叶中的CaMV 35s启动子的活性(平均200pmol/min/mg蛋白)与Comai等在Plant Mol.Biol.15373-81(1990)中的数据相当。35S增强子增倍后在叶中将GUS活性提高了两倍。将Comai等在Ioc.cit.中的数据与利用本发明结构获得的数据比较，结构5和6嵌合区分别在叶中指导的GUS表达比由35S启动子和增强的双倍35S启动子分别引导的强156倍和26倍。
还对含双倍35S-GUS或Mac-GUS结构的烟草植株的T2代的种子进行了试验。这些转基因植物叶中GUS活性的测定证实了上述启动子的相对强度。以下表I显示了含各种启动子-uidA融合体的转基因烟草植株叶中的平均GUS活性。
表 I
>a所有原转化体中的平均GUS活性bGUS活性高表达原初转化体(Comai等，同上)的F1后代中的平均GUS活性表II给出了含启动子-uidA融合体的转基因烟草植株F1代叶中的平均GUS活性。
表2
a.第一个数字表示特定的结构。第二个数字表示一种原初转化体。b.原初转化体的种子在含卡那霉素的琼脂板上萌发，将芽胚转移至含卡那霉素的培养基中并在约40天后进行测定。
试验了一系列以ocs最短启动子(-116至+296)为基础的嵌合结构以评价其组织特异性表达的强度和方式。如图4所示，ocs激活序列和启动子(图1中的结构8)在转基因烟草的叶、茎和根组织中指导低浓度但较一致的GUS活性(平均值在200和400pmole/min/mg蛋白间)。以一段较短的mas激活序列(-213至-318)替换ocs激活序列(结构9和10)产生的嵌合结构只在所有被检组织中指导低水平的GUS活性。
还试验了位于ocs启动子上游的一段较长mas激活序列(-111至-318；结构13和14)。这些结构只在根组织中指导了略有提高的GUS活性。除了在-66位发现的AS-1同系物外，在-290位也有一类似于AS-1元件的序列。虽然在较短的mas激活序列中也有该序列，但-213至-103之间的序列似乎才是指导根中优先性表达所必需的。
将一段较短的mas激活序列(-318至-213)邻接在ocs激活序列加启动子的上游(结构11和12)。与只含ocs激活序列加启动子的结构(结构8)相比，这些结构在叶、茎和根组织中指导的GUS活性分别提高了6倍、2.5倍和15倍(图5)。这些结构的表达略带根中优先性，表明可能发生了AS-1类似元件与ocs激活序列的相互作用。有趣的是，含较长mas UAS的结构(与ocs激活序列加启动子粘接；结构15和16)指导的GUS活性比含较短的mas激活序列的结构(结构11和12)指导的略低(见图5)。但是，与由ocs激活序列加启动子单独指导的表达相比，在mas启动子5′端组套的ocs和mas激活序列都能产生较大提高。实施例2转基因烟草植株中T-DNA拷贝数与GUS活性间的相关为了确定T-DNA拷贝数与GUS活性间的关系，对取自16株含结构5或11的转基因植物的基因组DNA进行了分析。首先，从植物组织中抽提出基因组DNA并用HindIII完全消化。参见Rogers和Bendich，PLANT MOLECULAR BIOLOGY(Gelvin和Schilperoot编辑，Kluwer Acad.Pub.，1992)。用HindIII消化10微克DNA，以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离片段，利用毛细管转移法将DNA洗脱到尼龙膜上。参见Maniatis等，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor1982)。在80℃真空烘烤2小时将核酸固定在膜上。在65℃，1.5×SSC(1×SSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、1.0％SDS、0.5％Blotto和0.5mg/ml切断的鲑精子DNA中预杂交2-4小时。用32P-dCTP标记的含GUS编码区序列(由pBI101.2制得的XbaI-SstI限制性核酸内切酶酶解片段)的探针在新鲜溶液中65℃杂交过夜。杂交完成后，将膜用以下溶液在室温下顺次洗涤15分钟2×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC/0.1％SDS。最后一次以0.1×SSC/0.1％SDS在50℃洗涤30分钟。
利用限制性核酸内切酶和杂交探针的复合体，根据杂交条带的数量和强度可以估计T-DNA拷贝数。在各个转化体中的整合的拷贝数由一至数个不等。GUS活性与整合的uidA基因数不相关。例如在某些情况下，含单个整合的uidA基因的植株在叶中表现出比含多个整合的uidA拷贝的植株高得多的GUS活性。实施例3转基因烟草植株中GUS活性和uidA mRNA间的相关因为GUS活性被用作表达强度的衡量标准，所以有必要确证该活性反映了uidA mRNA的稳态浓度。有报道说当使用mas2′启动子和uidA报道基因时，GUS活性与高浓度uidA mRNA不相关，这一关系因为该报道而显得特别重要。参见Hensgens等，PlantMol.Biol.20921-38(1992)。
所以，检查了含4种不同结构(结构2、5、8和11)的转基因植株个体的叶中分离得到的uidA mRNA稳态浓度。首先，根据Vries等，PLANT MOLECULAR BIOLOGY(Gelvin和Schilperoot编辑，Kluwer Acad.Pub.，1992)中的方法分离出总RNA。取5毫克样品在MOPS/EDTA缓冲液(50mM MOPS，1mM EDTA，pH7.0)中通过1.2％的琼脂糖凝胶进行甲醛凝胶电泳分级，然后印迹到尼龙膜上。利用琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色来检查RNA的完整性。核酸的荧光还可用于确定每一道加入了等量的RNA。杂交条件与前述基因组DNA分析相同。
杂交完成后，将膜用以下溶液在室温下顺次洗涤15分钟2×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC/0.1％SDS。最后一次用0.1×SSC/0.1％SDS在60℃洗涤30分钟。
使用衍生自GUS编码序列的杂交探针进行RNA印迹分析，发现了一个预期长度的转录产物(约2300核苷酸)。GUS活性与uidA稳态浓度间存在着紧密相关，这与Hensgens等的报道正相反。实施例4ocs和mas启动子与激活序列的不同复合体对细胞特异性的GUS表达方式的调控对转基因烟草组织进行组织学检查以确定GUS活性的细胞特异性表达方式。利用X-gluc对植物组织切片进行组织化学染色来揭示这些表达方式。
根据Jeffeerson和Wilson(同上)的方法进行这些组织化学研究。简而言之，植物材料用0.1-0.3％的甲醛、0.1M Triton X-100、0.1M磷酸盐缓冲液预固定20-40分钟，用0.1M磷酸盐缓冲液漂洗，然后以1-2mM X-gluc(溶于0.1M Triton X-100、0.1MEDTA、0.1M磷酸盐缓冲液)染色2-14小时。在含3-5％甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液中再固定2小时后，用70％的乙醇清洗样品，将其包埋在石蜡中，用旋转切片机切片(12-18mm)。以1.0％的高碘酸-0.5％希夫试剂(“PAS”)对组织切片进行复染色。
在含有mas启动子但没有mas激活序列(结构1)的植株叶组织的所有类型细胞中都没有测得GUS活性。含有受天然mas激活序列加启动子调控的uidA基因的植物叶肉细胞(包括栅栏细胞和海绵组织细胞)和保卫细胞中表现出中等GUS活性，但在表皮细胞中未测得GUS活性。在维管组织中，木质部管胞细胞中可观察到中强度的染色，但在韧皮部细胞和射线薄壁组织细胞中只见到较弱的染色。在含ocs激活序列三聚体和mas启动子(结构3和4)的叶片中可观察到相似的GUS活性表达方式。但是，在叶维管组织的所有类型细胞中，GUS活性极大地减弱。在mas激活序列加mas启动子前组套地连接ocs激活序列三聚体(结构5和6)不仅在叶肉细胞和保卫细胞中，而且在表皮细胞中产生了强GUS活性。该结果表明远端和近端激活序列都能相互作用以调控表达方式。在叶维管组织中，不论ocs激活序列三聚体是否与mas激活序列加启动子连接，表达方式都相似。
在含有最短ocs启动子(结构7)的叶组织中没有测得GUS活性。在叶片的横切面中，由ocs激活序列加启动子(结构8)指导的GUS活性表达与mas激活序列加启动子指导的相似。在uidA基因受由一个短mas激活序列和ocs激活序列加启动子构成的嵌合启动(结构11和12)子调控的植株叶片中也观察到该GUS活性表达方式。在叶支维管组织中，ocs激活序列加启动子只在管胞细胞中指导GUS活性表达。与mas激活序列加启动子相比，ocs激活序列加启动子在射线细胞和韧皮部细胞中指导中强度的GUS活性表达，在叶主维管组织的薄壁组织细胞、木质部管胞细胞中指导很弱的表达。在ocs激活序列加启动子前加或不加一个短mas激活序列，在叶维管组织中都可观察到相似的GUS活性表达方式。但是，在薄壁组织细胞、射线细胞和韧皮部细胞中的活性极大地提高。在含有mas激活序列加ocs启动子(结构9和10)的植株中未能测得GUS活性。
mas激活序列加启动子(结构2)在腺毛状体柄部指导GUS活性的弱表达，但在腺毛状体头部指导强表达。ocs激活序列三聚体与mas激活序列加启动子的可操作性地连接(结构5和6)产生相似的表达方式；但是，柄部细胞中GUS活性的相对水平有较大提高。毛状体中由含有一段短mas激活序列连接ocs激活序列加启动子的结构(结构11和12)指导的GUS活性表达在腺毛状体头部较强，而在柄细胞中较弱。
在转基因植株的茎中，mas激活序列加启动子(结构2)在皮层细胞中指导GUS活性弱表达。在射线细胞和韧皮细胞中可观察到强的GUS活性，但在木质部管胞细胞中的表达较弱。即使在mas激活序列加启动子的上游克隆一段ocs激活序列的三聚体(结构5和6)也不改变这种表达方式。当以ocs激活序列三聚体取代mas激活序列(结构3和4)时，可观察到一种不同的表达方式。在韧皮部细胞中GUS活性的表达仍然较强，但此时在射线细胞和木质部管胞细胞中变得较弱。与mas激活序列加启动子相比，ocs激活序列加启动子(结构8)在射线细胞和韧皮部细胞中指导较弱的表达，而在管胞细胞中指导强表达。当在ocs激活序列加启动子的上游加一段短mas启动子(结构11)时，表达方式基本保持不变。
由mas激活序列加启动子(结构2)指导的GUS活性在根组织中较不稳定。实际上，存在一种再生植株，在其根成熟区的根冠细胞、表皮细胞和根毛以及根皮层细胞、韧皮部细胞和木质部细胞中可测得GUS活性。但是，在根伸长区几乎测不到GUS活性。在mas激活序列加启动子前加上ocs激活序列三聚体(结构5和6)时，在根成熟区的各种类型细胞中不时地，但非总是能测得GUS活性。以ocs激活序列三聚体取代mas激活序列(结构3和4)只在根伸长区周围根皮层细胞和的内皮细胞中产生GUS活性。ocs启动子和激活序列(结构8)或一段短mas激活序列加ocs激活序列和启动子(结构11和12)指导uidA基因表达时，可观察到相似的GUS活性表达方式。实施例5新嵌合调节区与其它调节区的比较mas激活序列加启动子的活性在根组织中最强。mas激活序列加启动子结合一段ocs激活序列三聚体可提高GUS活性水平2至23倍。这种活性提高在叶组织中最显著，但也可见于茎和根组织。ocs激活序列加启动子的活性在转基因植株的叶、茎和根中大致相同。在ocs激活序列加启动子前连接“短”mas激活序列可提高GUS表达水平2至20倍。这种提高在叶组织中最显著。将多拷贝的ocs激活序列与mas激活序列加启动子组合可产生一个转录调控元件，它在叶中比35S启动子强约156倍，比“增强的”双倍CaMV 35S启动子强26倍，比Comai等在Plant Mol.Biol.15373-81(1990)中描述的“Mac”和“大Mac″启动子强4.2倍(参见图2和3，表I)。有关叶(“L”)、茎(“S”)和根(“R”)中35S和Mac启动子的数据显示在图6中。必须注意，由结构5和6表示的嵌合启动子的活性强于双倍CaMV 35S启动子、Mac启动子和大Mac启动子的活性是最小估计值。另外，含有这些结构的转基因植株细胞的组织化学分析表明，这些“组套”激活序列几乎在所有类型细胞中指导GUS活性的表达。例如，在木质部和叶表皮细胞经及叶肉细胞、保卫细胞、毛状体细胞、和韧皮部细胞中可测得GUS活性的强表达。在茎中，可在韧皮部细胞、皮层细胞和薄壁组织细胞中测得活性。在根中，在根成熟区的根尖、根毛和多数细胞中表现有GUS活性。
已经有了植物生长条件对不同嵌合启动子-uidA基因的可能影响的证据。Hensgens等在Plant Mol.Biol.20921-38(1992)中报道了在试管内生长的(其根生长在无菌琼脂中)植株中的GUS活性比在暖房中种植于土壤中的植株中的高3至10倍。另外，已发现，在受控环境条件下的土壤中种植的植物叶的GUS活性表达水平比在试管内种植的植株低。但是，由各种调节区指导的GUS活性相对水平基本保持相同，与植株的种植方式无关(表2，同上)。另外，自花传粉转基因烟草植株F1代叶中各种嵌合调节区的相对强度与原代转化体和再生植株中的相似(表2)。
在一特定植株中发现了mRNA稳态浓度与GUS活性间的紧密相关。该结果证实了将GUS活性分析用作表达强度的测定的可靠性。但是，这一发现与Hensgens等(同上)的发现相反。Hensgens等的相反发现可能是由于它们在RNA印迹分析中未使用变性条件。
Comai等(同上)发现，当植物种植在土壤中时，短于本文所用的一mas2′激活序列和启动子区段(-301，相对于-318)指导的GUS活性只有CaMV 35S指导的10％。包括-301上游在内的序列将GUS活性提高至是35S启动子指导的40％。Comai等总结，位于-300上游但与之靠近的一区段是mas2′启动子完全活性所必需的。由本文所述试验中所用的mas2′启动子(-318)指导的活性略强于35S启动子。
Langridge等(同上)证明，激素可诱导高出几倍的mas2′-lux融合基因的活性。虽然最初的分析是在含激素的试管种植植株上进行的，但是这些生长条件对结果并没有大的影响，土壤种植植株表现出相似的GUS活性相对水平证明了这一点。
Langridge等还证明，在转基因烟草的茎中，mas2′启动子在维管组织中表现出最大活性，而Saito等(同上)描述，烟草根部的根冠中染色较强，而在韧皮部细胞中较弱。本文所揭示的数据与这些报道十分一致。但是，Saito等在叶脉中测得了GUS活性而在叶肉细胞中却没有。在本文所述试验中，在含有mas2′-uidA嵌合基因的转基因植株叶肉细胞中可清楚地测得GUS活性。关于mas2′启动子在转基因烟草植株各种组织中的表达，本文所述的许多结果与Leung等的也十分一致。但是，Leung等在茎维管细胞中没有测出由他们的结构指导的GUS活性。
异源ocs或mas激活序列与一段mas或ocs激活序列加启动子的组合极大地增强了被检转基因烟草所有组织中的GUS活性水平。这些数据表明这些嵌合调节区的高表达是由在这些嵌合调节区中存在的正调控元件间的协作性相互作用而不是单纯的累加作用产生的。实施例6嵌合调节区在诱导型表达中使用本发明另一方面内容涉及可被创伤或害虫侵染诱导的启动子和上游激活序列的组合体。开发出的一种组合体(AmasPmas)在根组织中优先表达并可被病原体进攻所诱导，而另一种(AocsAmasPmas)的表达更广泛，但可被害虫的进攻进一步诱导。这些表达系统可用于针对如线虫或真菌等根害虫的基因，并将被用于抵抗昆虫类害虫和其它叶病原体。
使用被删除至-138的核心甘露碱合成酶启动子区来构建嵌合调节区。将该核心启动子与GUS编码序列融合并以胭脂碱合成酶(“NOS”)的聚腺苷酸化信号序列为末端。参见图7中结构1。
联用甘露碱合成酶启动子-318至-138的UAS和甘露碱合成酶核心启动子创建出图7中的结构2。图7中结构5和6含有两种取向的章鱼碱合成酶基因-333至-116的UAS三聚体。利用根癌土壤杆菌转化法将这些结构转染入烟草中。测定大量转基因植株体的叶、茎和根中的GUS活性。mas启动子加激活序列(图7中结构2)的活性在根中最强，在叶和茎中较弱。与结构2相比，mas激活序列和启动子加上ocs激活序列(图7中结构5和6)在根中将GUS活性提高10倍，在茎和叶中提高50至100倍。ocs激活序列的取向对结果无影响。
mas启动子加激活序列的创伤诱导性在转基因烟草植株的叶中可诱导30倍的活性，在茎中诱导17倍，在根中诱导3倍。
为了测试各种嵌合调节区通过病原体进攻的诱导性，以线虫感染含有结构1、2、5和6的各个转基因烟草植株，并监测其GUS活性的诱导作用。为了保证不发生线虫内GUS活性的内源表达，对成熟线虫卵的纯化制剂进行了分析。所用的线虫种为从西红柿根部分离的Meloidogyne incognita品种3。将感染后的根在10％的chlorox溶液中持续搅拌4分钟来分离成熟的虫卵。通过一个200目的网筛洗涤该溶液以去除根渣，并在一个500目的网筛上收集虫卵。清洗后使用一种线虫计数片(Olympic Equine Products公司)计数虫卵。作为对照，为了测定线虫内源GUS活性的存在，在pH5.5和pH7.5对虫卵进行试验。pH5.5时的GUS活性缘于由动物基因引发的内源表达，这将被作为背景活性。pH7.5时的GUS活性缘于细菌基因的表达。在两种pH下都只发现成熟线虫卵中GUS活性的最小值。所以，Meloidogyne incognita中没有可能导致试验中由于线虫卵存在而出现严重背景活性问题的细菌或动物的GUS活性。
以10,000个纯化线虫卵感染转基因植株，并在暖房条件下于沙土中种植数月。收获成熟植株的根并目测线虫感染部位。被感染部位会形成一个含线虫和卵囊的根癌，而未被感染部位则具有正常外观，由此可目测Meloidogyne incognita感染部位。用根癌来测定被感染区的GUS活性，而正常根区被用作未感染对照。所有未感染和被感染根之间的比较都以同一植株为基础，从而避免了位置效应和植株间基因表达的不同。在pH5.5和pH7.5测定使用结构1的7号植株(1-7)中GUS活性的诱导作用(图9中图A)。
表达水平低于含有结构2、5、6的转基因植株表明单独的Pmas启动子只表达基本活性水平且不被线虫感染所诱导。
当Pmas启动子含有mas激活序列Amas时(结构2)，GUS活性的表达水平较高且可被线虫感染所诱导(图9中B)。加上ocs启动子的UAS(Aocs)产生相似的线虫感染诱导作用(图9中C)。有一植株(5-5)不表现出诱导型表达。这可能是因为所用的根组织的老化或基因插入了染色体中某个会改变表达的位置，因为另一转化体(5-2)发生了诱导性应答。
这些结果说明，病原体侵染可诱导使用甘露碱合成酶启动子和mas或ocs激活序列的嵌合调节区。这些区域可被用于杀线虫毒素基因或可中断线虫摄食和增殖的激素化合物基因的表达。例如，苏芸金杆菌的某种毒素(“Bt毒素”)被发现可有效抵抗线虫。参见Adang等，Plant Molec.Biol.211131-45(1993)。美国专利5,281,530、美国专利5,322,932、PCT出版物WO92/04453和欧洲专利公开0517 367A1揭示了这些毒素的氨基酸序列和编码这些毒素的核苷酸序列。
这些诱导型调节区的应用并不限于杀线虫。这些调节区对导致创伤的其它病原体同样有效。实施例7嵌合调节区对杀虫毒素表达的调控本发明的嵌合调节区可被用于在转基因植株中调控杀虫毒素的表达。在某个优选实施例中，可将Bt毒素置于本发明调节区的调控下。
已开发出了改进型Bt毒素的编码基因以提高其在转基因植株中的表达水平。Perlak等在Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 883324-28(1991)中揭示了对cryIA基因的修饰作用以置换在植株中不被优选的序列。这些修饰作用被发现可提高活性CryIA毒素的水平。同样，Adang等(同上)揭示了为优化表达而进行的CryIIIA基因的修饰作用。Bt毒素家族中的其它成员也可被修饰并用于本发明中。还可以使用与超敏性应答有关的基因。参见Keen(同上)。总之，本发明不限于任何特定类型的毒素或化合物。由基因编码或由酶生产的任何类型的杀虫毒素或抗昆虫化合物，或由基因编码的其它实例都可与本发明联用。实施例8嵌合调节区对除草剂耐受性表达的调控本发明的嵌合调节区可被用于在转基因植株中表达对除草剂具有耐受性的基因。获得对除草剂耐受性有三种主要方式，即i)植物介导的除草剂解毒作用；ii)除草剂作用靶的增强表达；iii)除草剂结合位置的突变。参见Schulz等，Crit.Rev.Plant Sci.91-15(1990)。以上方式中的任何一种都可与本发明联用，但前两种方式更适于本发明。
已知有几种酶对多种常用除草剂有解毒能力。例如，谷胱甘肽-S-转移酶可提供对对称三嗪(s-triazine)和氯乙酰胺类除草剂的耐受性。例如参见Schulz等，同上；Shah等，Plant Molec.Biol.6203-11(1986)；Weigand等，Plant Molec.Biol.7235-43(1986)。可利用取自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的某一基因灭活除草剂phosphinothricin。参见De Block等，EMBO J.62513-18(1987)；Thompson等，EMBO J.62519-23(1987)。腈水解酶被发现可解毒除草剂bromoxynil。参见Stalker等，Science 242419-23(1988)。其它解毒酶也可与本发明联用。
另一种主要的耐药性产生途径是以除草剂作用靶的增强表达为基础的。例如除草剂草甘磷是5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshiki-mate)-3-磷酸酯合成酶(“EPSP合成酶”)的一种竞争性抑制剂。EP-SP合成酶的增强表达可产生草甘磷耐受性。利用本发明的强效、组成型启动子来调控EPSP合成酶序列的表达可获得EPSP合成酶的增强表达。另外，可将含有本发明启动子的多拷贝EPSP合成酶序列置于转基因植株中以获得更高水平的表达。各种来源的EPSP合成酶编码序列是已知的。参见Duncan等，FEBS Lett.17059(1984)；Stalker等，J.Biol.Chem.2604724-28(1985)；Shah等，Science233478-81(1986)。
最后，改变除草剂的结合位置也可被用于提供除草剂耐受性。Stalker等和Shah等发现，改变EPSP合成酶中的氨基酸可产生对草甘磷的耐受性。同样，乙酰羟酸(acetohydroxy acid)合成酶可提供对磺酰脲类和咪唑啉酮类的抗性。参见Schulz等，同上；Wek等，Nucl.Acid.Res.133995-4010(1985)。实施例9嵌合调节区对抗病毒基因表达的调控通过病毒基因或其反义对等物的表达可使植物具有抗病毒性。产生对病毒抗性的主要途径是通过i)蛋白质介导的抗性，通常是外壳蛋白；ii)反义RNA介导的抗性。Beachy等在Annu.Rev.Phy-topathol.28451-74(1990)中综述了以上两种途径。表达病毒外壳蛋白而不是反义RNA的转基因植物似乎表现出了对病毒更大的抗性。参见Beachy等，同上；Cuozzo等，Bio/technology 6549-57(1988)。
本发明的嵌合调节区被用于表达在转基因植物中产生抗病毒性的任何基因。例如，许多植物病毒的外壳蛋白氨基酸序列是已知的，由此就可以推断出核苷酸序列。另外，已知病毒外壳蛋白的核苷酸序列就可以准确合成反义RNA序列。这些序列可以在转基因植物中表达以获得抗性。
Cuozzo等(同上)揭示了黄瓜花叶病毒外壳蛋白的序列。还构建了含其它病毒序列的转基因植物。例如，Anderson等在Phytopath.791284-90中揭示了表达烟草花叶病毒和苜蓿花叶病毒的外壳蛋白的转基因植物。Hemenway等在EMBO J.71273-80(1988)中揭示了表达马铃薯病毒X的外壳蛋白和反义RNA的转基因植物。Huisman等在J.Gen.Biol.691789-98(1988)中揭示了该病毒的序列。Gerlach等在Nature 328802-05(1987)中揭示了表达烟草环斑病毒的卫星RNA的转基因植物。该卫星RNA可改善环斑病毒引起的病症。Eggenberger等在J.Gen.Virol.701853-60中揭示了黄豆花叶病毒的序列。但是，本发明的使用并不限于任何特定类型的病毒。任何类型病毒的序列可与本发明联用。
应当理解，说明、特定实施例、附图和数据在表明优选实施方法时被作为论述和例证，但并不是对本发明的限定。通过本文论述所揭示的内容，本发明范围内的各种改变和修饰对熟练技术人员来说将是显而易见的。
权利要求
1.用于在植物体内表达基因的嵌合调节区，其特征在于，它含有衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活序列，并与衍生自与所述第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因不同的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子可操作性地连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合调节区，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌基因是甘露碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌基因是章鱼碱合成酶基因。
3.根据权利要求1所述的嵌合调节区，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌基因是章鱼碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌基因是甘露碱合成酶基因。
4.表达某一基因的基因盒，其特征在于，它与嵌合调节区可操作性地连接，该调节区含有衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活序列，并与衍生自与所述第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因不同的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子可操作性地连接。
5.根据权利要求4所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌基因是甘露碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌基因是章鱼碱合成酶基因。
6.根据权利要求4所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌基因是章鱼碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌基因是甘露碱合成酶基因。
7.根据权利要求4所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的基因盒还含有一段胭脂碱合成酶的聚腺苷酸信号序列。
8.在植物体内表达基因的嵌合调节区，其特征在于，它含有至少两段衍生自某种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列，并与衍生自某种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子可操作性地连接。
9.根据权利要求8所述的嵌合调节区，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
10.根据权利要求8所述的嵌合调节区，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
11.根据权利要求8所述的嵌合调节区，其特征还在于，其中所述的上游激活序列之一与所述的启动子衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
12.表达某一基因的基因盒，其特征在于，它含有与一个嵌合调节区可操作性地连接的某一基因，该嵌合调节区含有至少两段衍生自根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列，并与衍生自某种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子可操作性地连接。
13.根据权利要求12所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
14.根据权利要求12所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的上游激活序列之一和所述的启动子衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
15.根据权利要求12所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
16.根据权利要求12所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的基因盒还含有一段胭脂碱合成酶的聚腺苷酸信号序列。
17.诱导型表达某一外源基因的基因盒，其特征在于，它含有与一个调节区可操作性地连接的所述外源基因，该调节区含有一个缺失至-138核苷酸位的根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的衍生启动子和衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的一段上游激活序列。
18.根据权利要求17所述的基因盒，其特征还在于，其中所述的基因盒还含有一段胭脂碱合成酶的聚腺苷酸信号序列。
19.诱导型表达某一外源基因的基因盒，其特征在于，它含有与某一调节区可操作性地连接的所述外源基因，该调节区含有一个衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子、衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的一段上游激活序列和衍生自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的一段上游激活序列。
20.在植物体内表达某一基因的方法，其特征在于，它具有以下步骤将所述基因与某一嵌合调节区连接，该嵌合调节区含有衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一段上游激活序列，并与衍生自与所述第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因不同的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子操可作性地连接；将所述基因和所述嵌合调节区插入某植株；令所述植株表达所述基因。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因是甘露碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因是章鱼碱合成酶基因。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征还在于，其中所述的第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因是章鱼碱合成酶基因，而所述的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因是甘露碱合成酶基因。
23.在植物体内表达某一基因的方法，其特征在于，它具有以下步骤将所述基因与某一嵌合调节区连接，该嵌合调节区含有至少两段衍生自某种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列，并与衍生自某种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的一个启动子可操作性地连接；将所述基因和所述嵌合调节区插入某一植株；使所述植株表达所述基因。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征还在于，其中所述的上游激活序列衍生自不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
26.根据权利要求23所述的方法，其特征还在于，其中所述的上游激活序列之一与所述的启动子衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
27.在植物体内诱导型表达某一外源基因的方法，其特征在于，它具有以下步骤将所述外源基因与某一调节区连接，该调节区含有一个缺失至-138核苷酸位的根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的衍生启动子和衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的一段上游激活序列；将所述外源基因和所述调节区插入所述植株；诱导表达所述外源基因。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征还在于，其中所述的诱导是通过昆虫或线虫对所述植株的进攻而实现的。
29.在植物体内诱导型表达某一外源基因的方法，其特征在于，它具有以下步骤将所述外源基因与某一调节区连接，该调节区含有一个衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子、衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的一段上游激活序列和衍生自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的一段上游激活序列；将所述外源基因和所述调节区插入所述植株；诱导表达所述外源基因。
30.一种质粒，其特征在于，它含有权利要求1所述的嵌合调节区。
31.一种质粒，其特征在于，它含有权利要求8所述的嵌合调节区。
32.一种质粒，其特征在于，它含有权利要求12所述的基因盒。
33.一种转基因植物，其特征在于，它含有权利要求30所述的质粒。
34.一种转基因植物，其特征在于，它含有权利要求31所述的质粒。
35.一种转基因植物，其特征在于，它含有权利要求32所述的质粒。
全文摘要
本发明提供了用于在植物体内表达外源基因的以根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因为基础的嵌合调节区和基因盒。各种衍生自如甘露碱合成酶和章鱼碱合成酶基因等冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列与启动子(或启动子加激活序列)可操作性地连接，然后将以上两者与外源基因可操作性地连接。这些调节区和基因盒可产生前所未有的表达水平和表达方式。
文档编号C12N15/11GK1136825SQ94194169
公开日1996年11月27日 申请日期1994年11月17日 优先权日1993年11月19日
发明者S·B·格尔文, R·豪普特曼, 倪敏, 崔德才 申请人:生物技术研究及发展有限公司, 泊达研究基金会