专利名称：用于检测伴随肾综合症的出血热相关病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测与伴随肾综合症的出血热相关病毒的方法，具体地说，涉及一种用遗传工程的方法对病毒特定核酸区段进行检测的方法。
本发明还涉及用遗传工程方法进行检测所使用的引物。
伴随肾综合症的出血热(下文简称HFRS)是一种传染性疾病，该疾病由啮齿类动物携带，并广泛存在于人类和各种动物中。在人类中，该疾病能引起伴随有以肾脏异常为主要症状的急性感染，而在啮齿类动物中常发现的是持续性感染，该感染因此成为这种疾病的感染源。
该综合症在包括远东地区的亚洲部分，俄罗斯及欧洲国家的广大地区均被发现。据最近报道，在美国也有发现[Science，262，914-917(1993)]。世界上每年这种疾病的患者人数达数十万。在日本，有实验用鼠被感染并由此被致死事例的报道。
自从1978年Lee等人从Apodemus agrarius的肺中分离出Hanta-an品系病毒以来，十多个品系的这类病毒(下文简称HFRSV)已经从野生或实验用鼠以及HFRS患者的肺脏、血液、肿瘤、胰脏等中被分离出来，包括在日本从实验用鼠中分离出的B-1品系。
属于Hantaan virus属的HFRSV Hantaan品系在远东地区的亚洲部分具有最强的致病性，引起的死亡率为10～15％[Anitekkusu，5(6)，273-276(1993)]。
B-1是属于Seoul属的HFRSV的一个品系。该病毒以鼠类为宿主，目前正流行于日本，并具有很强的感染性，但与Hantaan品系相比，其致病性较弱。
HFRSV是属于Bunyaviridae科的单链RNA病毒，其RNA是由被分别称为大链(L链)、中链(M链)和小链(S链)的三个片段组成的。
HFRSV RNA的复制是由RNA依赖的RNA聚合酶完成的。在含有活性病毒的被感染细胞内不仅含有基因组RNA的负链(vRNA)，也含有vRNA复制所必需的，与vRAN互补的正链RNA(cRNA)以及正链的mRNA。目前，HFRS是由血清检测结合根据临床症状的判断进行诊断的。近几年来，也有用聚合酶链式反应(PCR)方法进行其诊断的(JP-A-3-120000；Science，op.cit.)。
血清诊断法是用间接荧光抗体技术等检测方法进行的。由于抗体检测技术有很高的特异性，可以进行HFRS始发后的早期诊断。但是抗体检测技术只能间接表明病毒的情况，而不能直接表明病毒的存在。
每一个HFRSV颗粒是由四种蛋白质和基因组成的，而且HFRSV的特性是由基因决定的。
用PCR技术扩增HFRSV基因的特异核苷酸序列可在疾病的更早期，直接、快速而且高灵敏度地检测病毒的存在。
然而，迄今报道的PCR技术在检测临床采集的样品中，尤其是在以痕量存在有病毒的血液样品中的病毒的灵敏度方面还没有达到令人满意的水平。
本发明的目的是阐明一段可用PCR较高灵敏度地扩增的HFRSV核酸区域，从而提供了一种检测该区域的方法和在该方法中检测HFRSV所使用的引物。
本发明的第一方面涉及一种检测HFRSV的方法。该方法包括，通过逆转录和随后的两步PCR反应，扩增从序列表中SEQ ID NO1至5分别所代表的核酸组成的一组核酸中选出的至少一种核酸上的一部分序列及其互补序列。
本发明的第二方面涉及一种检测HFRSV的方法，该方法包括如下步骤(a)从待测样品中分离出核酸；(b)使用从序列表中SEQ ID NO6所示的核酸片段或其变异型序列，和/或序列表中SEQ ID NO7所示的核酸片段或其变异型序列选出的核酸片段为引物，将分离出的核酸进行逆转录，从而获得逆转录的产物DNA；(c)用序列表中SEQ ID NO6所示的核酸片段或其变异型序列，结合序列表中SEQ IN NO7所示的核酸片段或其变异型序列，将逆转录的产物DNA进行第一次PCR步骤，从而使DNA得到扩增；(d)用序列表中SEQ ID NO8所示的核酸片段或其变异型序列结合序列表中SEQ ID NO9所示的核酸片段或其变异型序列，将扩增的DNA进行第二次PCR步骤，从而获得再次扩增的DNA；以及(e)检测扩增DNA。
本发明的第三方面涉及一种检测HFRSV所用的引物，该引物具有序列表中SEQ ID NO6至9所示的核酸序列或其变异型序列。
另外，本发明的第四方面涉及一种检测HFRSV的试剂盒，该试剂盒包括一个具有SEQ ID NO6所示的核酸序列或其变异型序列和SEQ ID NO7所示的核酸序列或其变异型序列的引物对，以及另外一个具有SEQ ID NO8所示的核酸序列或其变异型序列和SEQ ID NO9所示的核酸序列或其变异型序列的引物对。
可通过检测HFRSV的基因来诊断HFRS。有许多检测基因的方法，但是两步PCR扩增法是获得高灵敏度检测的最优选方法。为达到这一目的，可考虑用属于Hantaan属的HFRSV基因序列来设计引物，这种病毒分布于远东地区的亚洲部分，并有最强的致病性。也可根据属于Seoul属的HFRSV的基因序列来设计引物，这种病毒广泛地分布于日本。为了确定与Hantaan属和Seoul属的HFRSV基因序列中高度同源并能用两步PCR法高灵敏度地进行检测的序列区域，本发明人以这些基因作为底物测试了不同的引物，发现目的核酸区段位于M链G2区，从而完成了本发明。
本发明将在下文中予以详细说明。
属于Hantaan属的HFRSV的已知品系包括Hantaan 76-118品系和Lee品系，属于Seoul属的包括B-1品系、80-39品系和SR-11品系。已经克隆了这些品系的基因组RNA的cDNA，而且它们的核苷酸序列分别发表于Virology，157，31-39(1987)，J.Gen.Virol.，69，1949-1955(1988)，Nucleic Acids Research，18，49 36-4937(1990)，Virus Research，19，47-58(1991)和Virology，176，114-125(1990)。
根据这些核苷酸序列，选出与Hantaan HFRSV和Seoul HFRSV高度同源的核酸区段来设计并合成出用于逆转录该核酸区段的引物，以及用于以逆转录产物DNA为模板的第一次PCR扩增(下文简称第一次PCR)的一对引物和用于以第一次PCR扩增产物DNA为模板的第二次PCR扩增(下文简称第二次PCR)的另一对引物。因此，本发明人所选出的Hantaan属和Seoul属的共同RNA区段的例子包括分别对应于序列表中SEQ ID NO10所示的Seoul B-1品系M链(cDNA)上核苷酸位点791至1224(A区)，2079至2522(B区)，2068至2585(C区；公开于Science，op.cit.的两步PCR扩增区域)，2495至2877(D区)和3083至3288(E区)。这些核酸区段在Hantaan属和Seoul属的HFRSV之间具有高度同源性。
下一步制备用于逆转录这些核酸区段的引物、用于第一次PCR的一对引物和用于第二次PCR的另一对引物。作为逆转录反应的引物可使用第一次PCR的一对引物中的任意一个。然而，同时使用一对引物可在待测样品中同时发生负链vRNA正链cRNA和mRNA的逆转录，这样适用于高灵敏度检测法。
对这些引物并没有特别的限制，只要它们能与选择出的区段退火配对并达到所需的扩增即可。由本发明人合成的用于逆转录和第一次PCR的引物对(下文简称为引物对A)以及用于第二次PCR的引物对(下文简称为引物对B)的例子列于表1中。
表1
用引物对A和引物对B进行检测的HFRSV RNA可分别从被Hantaan或Seoul品系病毒感染的细胞，如A549(ATCC CCL 185)，Vero(ATCCCCL 81)或Vero-E6(可从大阪大学微生物感染疾病研究所获得的一种原种培养细胞)，从被HFRSV感染动物的器官(例如肺脏、脾脏或脑)、血液、唾液、尿或粪便，或从HFRS患者的体液(例如血液、唾液或尿)制备出来。这些细胞中的任何一种均可使用，但在下述实施例中使用的是Vero-E6细胞。
PCR步骤可由已知的方法，如刊载于Methods in Enzymology，155，335-350(1987)的方法进行。根据制造商的说明，使用商品PCR试剂盒进行PCR反应则很简便，该试剂盒有例如可从TakaraShuzo获得的包括Taq聚合酶和逆转录酶的RNA-PCR试剂盒以及也可从Takara Shuzo获得的自动基因扩增仪(Perkin-Elmer Corp.)。
使用这样的试剂盒和扩增装置以及表1中的引物对，就可进行HFRSV的检测。在逆转录反应中，通过在42℃温浴反应混合物，就可从模板PNA合成单链cDNA。该反应混合物包括例如禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)引导的逆转录酶，引物对A和四种底物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。在随后的第一次PCR中，用下述方法将目的基因扩增。例如，选用热稳定的Taq聚合酶和引物对A以及任意数量的反应周期。每一反应周期包括DNA变性(94℃)，引物DNA退火(50℃)和DNA互补链的酶促合成(72℃)。下一步，用所述基因作为模板进行第二次PCR。在第二次PCR中用如下方法将目的基因扩增。例如，选用热稳定的Tag聚合酶和引物对B以及任意数量的反应周期，每一反应周期包括DNA变性(94℃)，DNA引物退火(45℃)和DNA互补链的酶促合成(72℃)。
表2表示检测每一核酸区段时的检测极限。该检测使用感染Seoul B-1品系病毒的Vero-E6细胞提取的RNA(0.001-0.1pg)作为模板，以及表1中的引物对A和引物对B作为引物。
表2核酸区段 检测极限A区 0.1pgB区 0.1pgC区 0.1pgD区 0.1pgE区 0.01pg
如表2所示，只有E区能以高于其它区段10倍的灵敏度被检测到，因此E区被认为是检测HFRSV最好的区段。
下面介绍以感染HFRSV大鼠血液为材料检测HFRSV的实例。这一实例是，抽取感染Seoul B-1品系病毒的大鼠血液，并用0.31％柠檬酸钠处理。用磷酸缓冲液将1ml该血液稀释一倍，上铺1mlFicoll(比重为1.0940)，然后在25℃离心，回收淋巴样细胞。用磷酸缓冲液将该淋巴样细胞彻底洗涤后，加入异硫氢酸胍(或硫氢酸胍)使该淋巴样细胞裂解。将裂解后的细胞提取物用苯酚和氯仿处理，然后加入2-丙醇沉淀从而回收RNA。表3表示以使用这样提取的RNA为模板，以表1中对应于E区的相应的引物对A和引物对B为引物对E区进行扩增的结果。将没被感染的大鼠血细胞进行同样处理，以作对照。
表3感染 DNA扩增是 是否 否如表3所示，特异DNA区段只能在被感染的大鼠血液中得到扩增，而且，通过检测E区段，血液样品中的HFRSV RNA可容易地高灵敏度地被检测出来。
因此，本发明中确定了用于检测HFRSV的核酸区段。这一核酸区段的实例包括序列表中SEQ ID NO1所示的源于Seoul B-1品系病毒的区段，序列表中SEQ ID NO2所示的源于Seoul 80-39品系病毒的区段或序列表中SEQ ID NO3所示的源于Seoul SR-11品系病毒的区段，序列表中SEQ ID NO4所示的源于Hantaan 76-118品系病毒的区段或序列表中SEQ ID NO5所示的源于Hantaan Lee品系病毒的区段。通过逆转录和随后的两步PCR反应扩增上述每一区段的一部分和其互补序列，能高灵敏度地检测出HFRSV。在下文中，序列表中SEQ ID NO1至5所示区段被称为“E′区段”。
检测E′区段及其互补序列所使用的引物对A和引物对B的例子包括序列表中SEQ ID NO6和7以及SEQ ID NO8和9分别所示的核酸片段。本发明中所使用的引物也可以是这些核酸片段的变异型序列。对这些变异型序列没有特别的限制，只要它们能够被用来检测E′区段及其互补序列。这些变异型序列包括上述SEQ ID NO6至9所示的基本引物的变异型，其中，核苷酸序列中的一些碱基被缺失，替换或被加入其它碱基。例如，Hantaan或Seoul HFRSV品系的突变体基因相应的核苷酸序列就存在这样的情况。在似乎对引物延伸反应的效率具有较大的影响的引物的3′末端区的，最好避免变异或减低突变率，在5′末端区引入变异更佳。为使引物与E′区段及其互补序列的突变体配对，必须把引物中对应于突变区的一个碱基替换成次黄嘌呤。序列表中SEQ ID NO27至30所示的核酸片段是分别对应于SEQID NO6至9所示的基本引物的变异型序列。使用这些变异型序列，可高效率地扩增上述E′区段及其互补序列。或者，一个变异型序列和一个基本引物可结合使用。
通过在本发明的引物上结合一个可检测的标记物，被扩增的DNA可被简单容易地检测出来。该标记物可以是放射性的，也可以是非放射性的，但优选使用非放射物质。可直接测定的非放射性物质的例子包括荧光物质，例如荧光素及其衍生物(如异硫氰酸荧光素等)或若丹明及其衍生物(如四甲基异硫氰酸若丹明，得克萨斯红等)；也包括化学发光物质，例如吖啶；还包括能产生延迟荧光的物质(如Pharmacia公司生产的DTTA)。
下文将详细介绍使用本发明的引物进行HFRSV检测的方法。
(1)待测样品用于检测目标HPRSV的存在的样品包括上文所述的HFRSV感染的动物细胞；从感染动物获取的器官、血液等；以及从感染病人获取的血液、唾液、尿等。
在这些样品中，从感染动物和病人获得的血液可被容易地、连续地诊断。提取并浓缩RNA对检测血液中的HFRSV是必需的。从血液中提取RNA有很多方法，一般可通过用Ficoll方法分离出淋巴样细胞后从淋巴样细胞中提取RNA。或者通过用阳性表面活性剂从少量血液中提取RNA[Nature，362，186-188(1993)]，优选使用Catrimox-14(Iowa Biotechnology Corp.生产)。
(2)逆转录和基因扩增若目标HFRSV存在于待测样品中，通过在样品中加入本发明的引物对A，并用逆转录酶将E′区段及其互补序列进行逆转录。随后，通过用本发明的引物对A进行第一次PCR，用本发明的引物对B进行第二次PCR，就能将从逆转录获得的部分E′区段有效地扩增。
(3)检测由两步PCR扩增获得的目的基因可用例如电泳[Saiki，Science，230，1350-1354(1985)]或使用标记探针的点杂交方法[Saiki，Nature，324，163-166(1986)]进行检测。为了制备探针，可通过从扩增区段内选择一段序列来设计探针DNA。该探针可用许多不同的已知方法标记，如酶标记，荧光标记，生物素-抗生物素蛋白标记，化学探针标记，同位素标记等方法。
对一特定HFRSV品系病毒的检测，可使用与各自品系RNA相应的引物。分别适用于各自品系的引物对的例子列于表4中。
表4引物(SEQ ID No.)品系 第一次PCR 第二次PCRHantaan 76-118 31333234Hantaan Lee35373638Seoul 80-3939414042Seoul SR-1143454446Seoul B-1 4749使用含有本发明的引物对A和B的试剂盒，可简便地进行HFRSV的检测。该试剂盒中还可包括从血液中分离淋巴样细胞所用的试剂、逆转录酶、PCR试剂等，从而能够快速、简单、容易、高灵敏度地检测血液中的HFRSV RNA。这些试剂可以是溶液形式，也可以是冷冻干燥的制品。
下面的实施例是为了更详细地说明本发明，不应认为是限定本发明的范围。
实施例1(1)制备引物DNA序列表中SEQ ID NO6至25所示的每一引物DNA片段都是用Applied Biosytems公司生产的DNA合成仪合成的。去除保护基后，用离交换HPLC(TSK胶，DEAE-2SW柱)进行纯化该片断，然后进行脱盐处理以得到DNA。
(2)从感染Seoul B-1品系病毒的细胞中提取细胞内RNA。
将动物细胞系Vero E6的细胞(从大阪大学微生物感染疾病研究所可获得的一种原种培养物)感染上Seoul B-1品系病毒，并在Roux′s瓶内50ml Eagle′s MEM培养基中在CO2培养箱内培养7天。离心收集所得细胞，并与异硫氰酸胍混合使细胞裂解。将获得的细胞提取物用苯酚和氯仿处理，然后用2-丙醇沉淀以回收RNA。
(3)从M链不同区段制备的引物在逆转录和两步PCR反应中扩增能力的比较。
使用表1中所示的5种类型的引物对A和引物对B，用RNA-PCR试剂盒(Takara Shuzo公司生产)对它们检测HFRSV的能力进行比较。
将实施例1-(2)中从B-1品系病毒感染细胞中提取的细胞内RNA用Tris-EDTA缓冲液(pH 8.3)稀释106、107和108倍，将每种这样稀释的样品1μl，分别与表1中的引物对A、RNA-PCR试剂盒中的dNTP混合物、氯化镁、10×RNA-PCR缓冲液和水混合，使总体积为18μl。将所得混合物在70℃加热3分钟，然后快速冷却。加入逆转录酶和RNA酶抑制剂之后，调整所得混合物的总体积至20μl，30℃温育10分钟，然后在42℃进行反应60分钟。
在99℃保持5分钟，使逆转录酶失活后，冷却反应混合物。然后与Taq DNA聚合酶，10×RNA-PCR缓冲液，氯化镁、相应的引物对A和水混合，使总体积为100μl。将100μl矿物油(Takara Shuzo生产)加入反应液的上层，然后用自动基因扩增仪(Thermal Cycler480，Perkin-Elmer公司生产)进行扩增反应。反应进行40个周期，每一周期依次包括94℃变性30秒，55℃引物退火30秒和72℃合成反应30秒。
反应完成后，将3μl(占3％)反应溶液置于一小管内，与TaqDNA聚合酶，10×RNA-PCR缓冲液，氯化镁，dNTP混合物，表1中相应的引物对B和水混合至总体积100μl。加入100μl矿物油于反应液上层后，用自动基因扩增仪Thermal Cycler 480进行扩增反应。
反应进行40个周期，每一周期依次包括94℃变性30秒，55℃引物退火30秒和72℃合成反应30秒。
反应完成后，除去上层的矿物油，将10μl反应溶液在3％NuSieve GTG琼脂糖-1％ Sea-Kem琼脂糖(FMC公司生产)的凝胶上电泳，然后用溴化乙锭使DNA染色来显示扩增的DNA。
结果是，当使用表1中各自的引物对A和引物对B时，E区可在稀释107倍的样品中得到特异扩增，而A至D区只有在稀释106倍的样品中得到扩增，从而证实了E区是检测HFRSV最好的区段。这时，B-1品系病素感染细胞的1μl稀释107倍的RNA溶液中含有0.01 pg RNA。
(4)制备试剂盒使用用于检测E′区及其互补序列的引物，AMV引导的逆转录酶(由Takara Shuzo生产)，Taq聚合酶(由Takara Shuzo生产)，RNA酶抑制剂(由Takara Shuzo生产)，10×RNA-PCR缓冲液，底物(dNTP混合物)，氯化镁和正对照用RNA来制备表5所示的用于HFRSV检测的试剂盒。
在这种情况下，实施例1-(2)中获取的RNA用作试剂盒中的试剂G。
表5HFRSV检测试剂盒(用于100个测试)试剂A逆转录酶50单位/μl 10μl试剂BTaq DNA聚合酶5单位/μl 100μl试剂CRNA酶抑制剂 40单位/μl 50μl试剂D10×RNA-PCR缓冲液 2ml100 mM Tris-HCl pH 8.3500 mM KCl试剂E25 mM MgCl21.6ml试剂FdNTP混合物 1.6mldATP，dCTP，dATP和dTTP的浓度均为2.5mM试剂G正对照RNA10pg/μl 50μl试剂H引物对A 各200μlHS-HF 3-1 20 pmol/μlHS-RS 3-1 20 pmol/μl试剂I引物对B 各100μlHS-HF 3-2 20 pmol/μlHS-RS 3-2 20 pmol/μl
实施例2从HFRSV感染的大鼠血液中检检HFRSV定期地从Seoul B-1品系病素感染的大鼠体中抽取血液，并用0.31％柠檬酸钠处理。用磷酸缓冲液将处理后的每种样品1ml稀释1倍，上层铺1ml Ficoll(比重为1.0940)，然后在25℃离心以回收淋巴样细胞。用磷酸缓冲液彻底洗过之后，在细胞中加入异硫氰酸胍使细胞裂解。
将从裂解获得的细胞提取物用苯酚和氯仿处理，然后用2-丙醇沉淀以回收RNA。将回收的RNA贮存于-80℃的冰箱中，使用时，将其溶于10μl Tris-EDTA缓冲液中。
这种情况，是将Seoul B-1品系病毒细胞(约103f.f.u)注射入6周龄的雄性大鼠腹膜内，使其感染并发病。感染(发病)1周和2周后抽取血液。另外，抽取感染前大鼠的血液作为对照。
用上述动物血液中获取的RNA及实施例1-(4)中所述的试剂盒，以下述方式进行HFRSV的检测。
从上述动物血液中获取的RNA溶液1μl与引物对A，dNTP混合物，MgCl2和10×RNA-PCR缓冲液混合。这些都包括在实施例1-(4)所述的试剂盒中，并且每一种均为一次测试量。用水将总体积调整至18μl后，70℃加热该混合物3分钟，然后快速冷却。向其中加入一次测试量的逆转录酶和RNA酶抑制剂，并将该混合物的总体积调整至20μl，在30℃温育10分钟，然后在42℃反应60分钟。99℃温育5分钟使逆转录酶失活之后，将反应混合物冷却，并与包括在试剂盒中的一次测试量的Taq DNA聚合酶，10×RNA-PCR缓冲液，MgCl2，和引物对A混合。将总体积用水调整至100μl。
在反应液的上层加上100μl矿物油，用自动基因扩增仪Therm-al Cycler 480进行扩增反应。反应进行40个周期。每一周期依次包括94℃变性30秒，55℃引物退火30秒及72℃合成反应30秒。反应完成后，将3μl(占3％)的反应溶液置于一小管内，并与包括在试剂盒中的一次测试量的Taq DNA聚合酶，10×RNA-PCR缓冲液，MgCl2，dNTP混合物及引物对B混合。将该混合物的总体积用水调整至100μl。将100μl矿物油加至反应液的上层，用自动基因扩增仪Thermal Cycler 480进行扩增反应。
反应进行40个周期，每一周期依次包括94℃变性30秒，55℃引物退火30秒和72℃合成反应30秒。
反应完成后，去除上层的矿物油，并将10μl反应溶液在3％NuSieve GTG琼脂糖-1％Sea-Kem琼脂糖凝胶上电泳，然后用溴化乙锭染色证实经扩增的DNA。
结果是，只有从被感染的大鼠血液所获取的样品中，Seoul B-1品系病毒RNA的M链核苷酸序列上一段长度为119 bP的片段得到扩增。用双脱氧序列分析法分析该DNA片断核苷酸序列的结果表明，该片段是来源于Seoul B-1品系病毒的核苷酸序列。
定期从HFRSV感染的大鼠中抽取的血液进行HFRSV检测的结果列于表6。
表6感染前 1周后2周后-+ + +-表示没有特异基因扩增+表示有特异基因扩增++表示有很强的扩增如表6所示，即使在感染的早期(感染后1周)，用本发明的方法就可证实病毒的存在，这时，常规的血清学方法是不能检测出病毒的。
根据本发明，样品中含有的HFRSV可被直接、快速、高灵敏度地检测出来。这样，伴随肾综合症的出血热就可简单、容易地得到确诊。本发明提供的HFRSV检测方法和检测引物，对诸如实验动物的管理，以HFRSV监控的环境的净化以及HFRSV病人的诊断等方面有很大的效用。序列表SEQ ID NO1序列长度206序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组RNA序列描述GGUGCACCAU CAUCAUAAAC UUUCUCGUUU UCUAACUCAG AGAUACCAUU UACCUUAUCC 60AGAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU GAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCAUUUA 120AAUGAAGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCA GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180AGUGUUACAC UUUCUGCACC GUAACA 206SEQ ID NO2序列长度206序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组RNA序列描述GGUGCACCAU CAUCAUAAAC UUUCUCAUUU UCUAACUCAG AGAUUCCAUU UACCUUAUCU 60AAAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU AAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCACUUA 120AAUGAGGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCG GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180AGUGUCACAC UUUCUGCACC AUAACA 206SEQ ID NO3序列长度206序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组RNA序列描述GGUGCACCGU CAUCAUAAAC UUUCUCGUUU UCUAACUCAG AGAUACCAUU UACCUUAUCC 60AGAUGUGGUG CACUGGCUUG GAGGCCAGUU GAUGAACAUU CUUUCCCAUG ACAGCAUUUG 120AAUGAAGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCG GUAAUUUUGA CAGUAUUUUG UCCUCGUGAG 180AGUGUCACAC UUUCUGCACC AUAACA 206SEQ ID NO4序列长度206序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组RNA序列描述GGUGCCCCAU CAUCAUAUAC UUUACUAUUU UCUAUCUCAG AAAUCCCAUU UACCUUGUCA 60AGGUGAGGUG CAGCAGCAUG GAGUCCAAUU UGUGAACAGU CCUCCCCAUG GCAACACCUA 120AAUGUUGAAC CACUAUGGCC ACCUUUCCCU GAUACCUUGA CUGUAUUUUG UCCUCUUGUC 180AAUGUUACAC UCUCUGCACC AUAACA 206SEQ ID NO5序列长度206序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型基因组RNA序列描述GGUGCUCCAU CAUCAUAUUC UUUGCUAUUU UCCAUCUCAG AAAUCCCAUU GACCUUGUCU 60AGGUGAGGUG CAGCAGCAUG GAGUCCAAUU UGUGAACAGU CCUCCCCAUG GCAACACUUA 120AAUGUUGAAC CACUAUGGCC ACCUUUUCCU GAUACCUUGA CUGUAUUUUG CCCUCUUGUU 180AAUGUUACAC UCUCUGCACC AUAACA 206SEQ ID NO6序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTATGGYG CAGAGAGTGT RAC23SEQ ID NO7序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCHCCRT CATCATAWWC TTT23SEQ ID NO8序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGRAAAGGTG GCCATAGTGG TTC23SEQ ID NO9序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCYAWCTCAG ARATHCCATT KAC23SEQ ID NO10序列长度3651序列类型核酸链型双链拓扑结构线型分子类型基因组RNA的cDNA序列描述TAGTAGTAGA CTCCGCAAGA AACAGCAGTT AAATAACAGC AGGATCATGT GGAGTTTGCT 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GATAGAGGCA AAAATCCCTC ATACAGTGAG 960CTCCAAGAAC TTAAGATTGG CTGCTTTTGC AGGTATTCCA TCATACTCAT CAACTAGTAT 1020ATTGGCTGCT TCAGAAGATG GTCGTTTCAT ATTTAGTCCT GGTCTATTTC CTAACCTAAA 1080TCAGTCAGTC TGTGACAACA ATGCACTCCC TTTAATCTGG AGGGGCCTAA TTGATTTAAC 1140TGGATACTAT GAGGCAGTCC ACCCTTGTAA TGTATTCTGT GTCTTATCAG GACCAGGTGC 1200TTCATGTGAA GCCTTTTCAG AAGGAGGTAT TTTCAATATT ACTTCTCCAA TGTGCCTGGT 1260GTCCAAGCAG AATAGGTTTA GAGCAGCTGA GCAGCAGATC AGCTTTGTCT GCCAAAGGGT 1320TGATATGGAT ATTATAGTGT ACTGTAATGG TCAGAAAAAA ACAATCTTAA CAAAAACATT 1380AGTTATAGGC CAATGCATTT ATACTATTAC AAGTCTCTTT TCACTGTTAC CAGGGGTTGC 1440CCATTCTATT GCTATTGAGT TGTGTGTTCC AGGGTTTCAT GGCTGGGCCA CAGCTGCACT 1500TTTGATCACA TTCTGCTTTG GCTGGGTATT GATTCCTGCA TGTACATTAG CTATTCTTTT 1560AGTTCTTAAG TTTTTTGCAA ATATCCTTCA TACAAGCAAT CAAGAGAACC GATTCAAAGC 1620CATTCTACGG AAAATAAAGG AGGAGTTTGA AAAAAGAAAG GGTTCCATGG TTTGTGAGAT 1680CTGTAAGTAT GAGTGTGAAA CATTAAAAGA ATTGAAGGCA CATAATCTAT CATGTGTTCA 1740AGGAGAGTGC CCATATTGCT TTACCCACTG TGAACCGACA GAAACTGCAA 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ACTTTACCAT TAAAAACTTA ACCTGGCTCT AATATCTGAT AACTAACTTT 3540CATTTTTATT TTTATATGGA TTAATTACTA AAAAAAATAC TCTCTTCTAT CTCCCAATCT 3600TTTATTGATT CACCGGGGTG TTGTCTTGAC ATCCTGCGGA GTCTACTACT A 3651SEQ ID NO11序列长度22序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGRAACTCYG CMCCHRTATA TG22SEQ ID NO12序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述CCTTCWGAAA AGGCYTCACA TGA23SEQ ID NO13序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCACCRCATG GRGAAGAYCA TGA23SEQ ID NO14序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述RGGGTGGAYW GCYTCRTAGT ATC23SEQ ID NO15序列长度22序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述CATCYAGTTC YARGTAYACA TA22SEQ ID NO16序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GCCTAGWYAC AAARCAATCR TTC23SEQ ID NO17序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCMTTTCAYT GTTATGGTGC20SEQ ID NO18序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述AGGTDYTCYT CMCCRAAYTG20SEQ ID NO19序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述CTTTTCTTTG CCATCCAGTT CTA23SEQ ID NO20序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGAACAGTAG AGTGTCACCT TGA23SEQ ID NO21序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述CCTCATTTCA TTGTTATGGT GCC23SEQ ID NO22序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GCCTAGTCAC AAAGCAATCA TTC23SEQ ID NO23序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GATATGAATG ATTGYTTTGT20SEQ ID NO24序列长度17序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述CCATCAGGGT CTYTCCA17SEQ ID NO25序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTATAATTG GGACWGTATC TAA23SEQ ID NO26序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GCAAAGTTAC ATTTYTTCCT20SEQ ID NO27序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTAYGGTG CAGARAGTGT RAC23SEQ ID NO28序列长度22序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GYGCHCCRTC ATCATAWWCT TT 22SEQ ID NO29序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GRRAAAGGTG GCCATAGTGG TTC23SEQ ID NO30序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述YCYAWCTCAG ARATHCCATT KAC23SEQ ID NO31序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTATGGTGCAGAGAGTGTAACSEQ ID NO32序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCCCCATCATCATATACTTTSEQ ID NO33序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGGAAAGGTGGCCATAGTGGTTCSEQ ID NO34序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCTATCTCAGAAATCCCATTTACSEQ ID NO35序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTATGGTGCAGAGAGTGTAACSEQ ID NO36序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCTCCATCATCATATTCTTTSEQ ID NO37序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGAAAAGGTGGCCATAGTGGTTCSEQ ID NO38序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCCATCTCAGAAATCCCATTGACSEQ ID NO39序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTATGGTGCAGAAAGTGTGACSEQ ID NO40序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCACCATCATCATAAACTTTSEQ ID NO41序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGGAAAGGTGGCCATAGTGGTTCSEQ ID NO42序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCTAACTCAGAGATTCCATTTACSEQ ID NO43序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTATGGTGCAGAAAGTGTGACSEQ ID NO44序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCACCGTCATCATAAACTTTSEQ ID NO45序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGGAAAGGTGGCCATAGTGGTTCSEQ ID NO46序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCTAACTCAGAGATACCATTTACSEQ ID NO47序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TGTTACGGTGCAGAAAGTGTAACSEQ ID NO48序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGTGCACCATCATCATAAACTTTSEQ ID NO49序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述GGGAAAGGTGGCCATAGTGGTTCSEQ ID NO50序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线型分子类型其它核酸(合成DNA)序列描述TCTAACTCAGAGATACCATTTAC序列表中，除A、T、U、G和C以外的符号具有以下含义。
YT或C，RG或A，HA，C或T，WA或T，KG或T，MA或c，DA，G或T
权利要求
1.一种检测与伴随肾综合症的出血热相关的病毒的方法，该方法包括，通过逆转录和随后的两步聚合酶链式反应(PCR)，扩增从序列表中SEQ ID NO1至5分别代表的核酸组成的一组核酸中选出的至少一种核酸上的部分序列及其互补序列。
2.一种检测待测样品中含有伴随肾综合症的出血热相关病毒的方法，该方法包括如下步骤(a)从待测样品中分离出核酸；(b)用序列表中SEQ ID NO6所示的核酸片段或其变异型序列，和/或序列表中SEQ ID NO7所示的核酸片段或其变异型序列为引物，将分离出的核酸进行逆转录，从而获得逆转录的DNA产物；(c)用序列表中SEQ ID NO6所示的核酸片段或其变异型序列，结合序列表中SEQ ID NO7所示的核酸片段或其变异型序列，将逆转录的产物DNA进行第一次PCR，从而使DNA扩增；(d)用序列表中SEQ ID NO8所示的核酸片段或其变异型序列结合序列表中SEQ ID NO9所示的核酸片段或其变异型序列，将扩增的DNA进行第二次PCR，从而获得扩增的DNA；以及(e)检测扩增的DNA。
3.用于检测伴随肾综合症的出血热相关病毒的引物，其具有序列表中SEQ ID NO6、7、8或9所示的核酸序列或其变异型序列。
4.权利要求3中所述的引物，其中SEQ ID NO6、7、8和9所示序列的变异型序列分别是SEQ ID NO27、28、29、30所示的核酸序列。
5.一种检测伴随肾综合症的出血热相关病毒的试剂盒，该试剂盒包括具有由SEQ ID NO6所示的核酸序列或其变异型序列和由SEQ ID NO7所示的核酸序列或其变异型序列的一对引物，和具有由SEQ ID NO8所示的核酸序列或其变异型序列和由SEQ ID NO9所示的核酸序列或其变异型序列的另外一对引物。
6.权利要求5所述的试剂盒还包括从血液淋巴样细胞中分离RNA所用的试剂、逆转录酶和PCR试剂。
7.权利要求5所述试剂盒还包括逆转录酶，DNA聚合酶，RNA酶抑制剂，缓冲液，氯化镁，dNTP混合物和正对照用RNA。
全文摘要
本发明提供了一种检测与伴随肾综合症的出血热相关病毒(下文简称HFRSV)的方法。该方法包括，通过逆转录和随后的两步PCR反应，扩增从序列表中SEQ ID NO∶1至5分别代表的核酸所组成的一组核酸中选出的至少一种核酸上的部分序列及其互补序列，一种通过检测由上述方法扩增的DNA在待测样品中检测HFRSV的方法，一类具有特异核酸序列或其变异型序列的用于HFRSV检测的引物。
文档编号C12P19/00GK1122835SQ9510546
公开日1996年5月22日 申请日期1995年5月6日 优先权日1994年5月6日
发明者水谷滋利, 向井博之, 大岛淳, 浅田起代藏, 竹迫一任, 加藤郁之进, 伊势川裕二 申请人:宝酒造株式会社