专利名称：乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属酶抑制剂的筛选方法，特别涉及的是乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。
创制超高效低毒除草剂的首要任务是寻找先导化合物。快速，准确地发现先导化合物需要全新意义的，分子水平的离体筛选方法。选用乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，缩写ALS)做靶标，是当前国际上除草剂研究和开发的前沿热点。ALS酶抑制剂被誉为“农药科学发展史中的里程碑”。现已确认磺酰脲类，咪唑啉酮类，及三唑并嘧啶类化合物为ALS酶的抑制剂。新结构类型的ALS酶抑制剂也不断涌现。目前国内有一般的整体测定除草活性的盆栽筛选方法，该法判定筛选效果所需时间长，一般要10到14天，通过观查和手工测量给出结果。其结果误差较大，灵敏度低，而且不能有效地阐明抑制作用机理。经检索，美国专利US 5,141,870号公开了核酸碎片编码的除草抗性植物；US 5,206,135号公开了氧敏感电极测ALS酶活性。两份专利未论及ALS酶抑制剂筛选方法。国际上有的文献公开了有关酶促反应的一些资料，但也是零星的，如①Shaner D.L.，Anderson P.C.，Plant Physiology，76，545-546(1984)植物生理学杂志②HoltzclaW W.D.，Journal of Bacteriology，121，917-922(1975)细菌学杂志③Giuseppt Forlanl，Weed Science，39，553-557(1991)杂草科学杂志文献①报导了酶促反应溶液组成和浓度，K2HPO420mM，丙酮酸钠20mM，TPP 0.32mM，MnSO40.5mM。组成中金属离子用的是锰离子，反应结束后还需离心，除去沉淀，硫酸根的存在也影响产物的生成。文献①，②，③介绍了反应溶液的体积为0.5ml，该值较小，说明加入的各反应物更少，引起相对误差会更大，易误导抑制活性的测定结果。文献②虽给出了酶促反应时pH值和光密度E的关系，但在pH4-8范围内没有稳定的E值，无最佳pH范围会导致测定光密度E值不准确。上述资料中均未完整报导乙酰乳酸合成酶抑制剂的筛选方法，所以该方法目前在国内外公开发表的资料中还是空白。国家“八五”技攻关项目中已明确提出“努力创建新的筛选模型”，这就是我们当前的任务。
本发明的目的是建立一套完整，规范，全新的分子水平离体乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。要求该方法离开植物体，在实验室的试管中将被筛选物在乙酰乳酸合成酶的催化作用下参加反应，通过酶促反应速率下降，即产物的减少，快速，准确地计算被筛选物的抑制活性，从而筛选出乙酰乳酸合成酶的抑制剂。
本发明的又一目的是应用上述方法，快速，准确地确定抑制剂化合物的乙酰乳酸合成酶抑制中浓度Ic50值，从而筛选出有可能开发为高效除草剂的先导化合物。
本发明的目的是这样实现的1.选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由乙酰乳酸合成酶的底物，辅酶，和缓冲液配制而成，反应过程为测定反应体系中不合被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的，被抑制的酶促反应速率V1，根据二者比值确定抑制活性百分数i％，其公式为i%=(1-V1V0)×100%---(1)]]>反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式(1)成为i%=(1-E1E0)×100%---(2)]]>根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤(1).首先选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制其溶液；(3).确定进行酶促反应的反应物中底物，辅酶，和缓冲溶液的组成及浓度；(4).在有酶，水，和缓冲溶液配成的反应液中，再按以下四种情况(I，II，III，IV)加入不同的物质进行酶促反应，分别测出四种情况下的产物量E值；在反应液中加入溶解被筛选物的溶剂而不加被筛选物时I.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA；II.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB；在反应液中加入被筛选物溶液后III.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA1；IV.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB1；(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物时的酶促反应产物量EA之差，该值表达式E0＝EB－EA(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的残余活性E1，该值表达式E1＝EB1－EA1(7).根据上述的公式(2)，计算被筛选物的抑制活性。
2.所述的乙酰乳酸合成酶酶促反应空白产物，系指乙酰乳酸合成酶在无(外加)酶反应物的酶反应条件下，仍不断进行酶促反应，产生的产物为空白。
3.乙酰乳酸合成酶酶的比活值为5-12μM/mg·hr，酶促反应的反应物中底物，辅酶，和缓冲溶液的组成及浓度和酶促反应的条件及产物如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底物丙酮酸钠CH3.CO.COOH 15.5mM辅酶氯化镁MgCl20.4mM硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM 在上述反应物中加入0.1ml的溶剂和0.5ml的酶，配制成2.6ml的反应溶液，在常压，39—40℃下，进行一小时酶促反应，生成产物乙酰乳酸。
4.第3条所述的乙酰乳酸合成酶酶促反应溶液的最佳pH值在6.9—7.5。
5.测定乙酰乳酸合成酶酶促反应产物乙酰乳酸的方法用测酶活的方法。
6.第5条所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的测酶活的方法可用分光光度法，系测定乙酰乳酸在硫酸作用下转化为3-羟基丁酮的含量，反应过程为分光光度法依次包括如下步骤(1).向2.6ml的酶促反应溶液中加入0.05—0.25ml，6N的H2SO4；(2).将上述溶液在59—60℃下恒温15分钟；(3).加入0.5—1.5ml，0.5％的肌酸(一种含胍基化合物)；(4).再加入1—2ml，5％的1-碱萘酚，生成红色络合物；(5).测定溶液体积为3—7ml；在59—60℃，常压下恒温20分钟；(6).取出溶液，摇匀后静置30—40分钟；(7).用分光光度仪测定E值，波长为520nm，1cm比色皿。
7.溶解被筛选物的溶剂可选用水体系。
8.溶解被筛选物的溶剂可选用丙酮体系。
9.溶解被筛选物的溶剂可选用四氢呋喃体系。
10.溶解被筛选物的溶剂可选用二甲亚砜体系。
11.上述第1条所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，可用于确定被筛选抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值，据此确定创制新农药时的先导化合物，其确定步骤如下(1).选用不同浓度的同一种抑制剂，按权利要求1所述的方法，分别同时进行酶促反应；(2).根据酶促反应结果，得到不同浓度时对应的酶活值，进而确定同一抑制剂在不同浓度时的残余活性百分数，即100％-i％；(3).用抑制剂的浓度及所对应的残余活性百分数为坐标，绘制灵敏度曲线；(4).根据曲线找出残余活性为50％时，也就是抑制活性i％为50％时所对应的浓度，即为该抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值，据此确定创制新农药时的先导化合物。
本发明的方法是以酶活及酶活的测定为基础。酶活指酶催化一定的化学反应的能力，实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速率。在酶促反应中，若加入一种化合物能抑制或阻断酶的催化能力，化学反应的速率将发生变化，我们可以选择不同的技术手段，测定随时间而变化的底物的减少或产物的增加，来代表催化反应的速率。通过被筛选化合物存在和不存在两种条件下的酶促反应速率的比较，计算抑制活性，从而筛选出高抑制活性的抑制剂化合物。
乙酰乳酸合成酶是一种裂合酶，其催化反应类型为脱羧和碳-碳键生成。底物系列是(ⅰ)丙酮酸，(ⅱ)丙酮酸和α-丁酮酸；产物系列是(ⅰ)乙酰乳酸，(ⅱ)乙酰羟基丁酸；经转化而适于测定的产物系列为(ⅰ)3-羟基丁酮，(ⅱ)丁二酮。
乙酰乳酸合成酶在辅酶硫胺素焦磷酸，黄素腺嘌吟双核苷酸，及镁离子的存在下，在适宜的磷酸盐缓冲液中，催化底物丙酮酸为产物乙酰乳酸。随时间而变化的乙酰乳酸的含量代表了该化学反应速率。乙酰乳酸可用气相色谱法测定，也可用分光光度法测定。若用分光光度法测定，则在产物乙酰乳酸中加入硫酸，停止酶促反应，乙酰乳酸同时转变为3-羟基丁酮，在一种含胍基化合物肌酸的作用下，3-羟基丁酮与1-碱萘酚形成红色络和物。由络和物光吸收曲线确定络合物最大吸收波长520nm为测定波长，用1cm比色皿比色，以光密度E值计算产物含量，见
图1。图中横坐标为吸收波长，单位为nm；纵坐标为光密度值E；虚线为络合物光吸收曲线；实线为空白。
酶促反应条件的确定1.在确定酶促反应温度为39-40℃的情况下，反应产物与反应时间有关，若以60分钟为准，30分钟时约为其70％。
2.酶促反应体系的pH值对酶促反应速率的影响见图2。图中横坐标为pH值；纵坐标为光密度值E。
3.在底物足够量，温度和pH值恒定时，反应产物与酶浓度成线性关系，见图3。图中横坐标为酶用量，单位为ml；纵坐标为光密度值E。
4.在酶浓度，温度和pH值恒定时，反应速率随底物浓度而改变，并且在某一浓度下达最大值V，V/2时的底物浓度即为米氏常数Km，本实验值为3-4mM，见图4。图中横坐标为底物浓度单位为mM；纵坐标为光密度值E。
5.酶促反应速率测定中，有关参数的确定都是通过实验获得的。包括脱羧时加硫酸的用量；肌酸用量；1-碱萘酚用量；显色反应的温度；络和物稳定时间的确定；和标准物3-羟基丁酮的工作曲线，可分别依次见图5；图6；图7；图8；图9；和图10。图5中，横坐标为6N H2SO4的用量，单位为ml；纵坐标为光密度值E。图6中，横坐标为0.5％肌酸的用量，单位为ml；纵坐标为光密度值E。图7中，横坐标为5％1-碱萘酚的用量，单位为ml；纵坐标为光密度值E。图8中，横坐标为溶液显色反应温度，单位为℃；纵坐标为光密度值E。图9中，横坐标为标准物3-羟基丁酮的用量，单位为μg；纵坐标为光密度值E；a曲线为显色55分时的测定值；b曲线为显色75分时的测定值；c曲线为显色25分时的测定值。图10中，横坐标为标准物3-羟基丁酮的用量，单位为μg；纵坐标为光密度值E。
本发明所用的乙酰乳酸合成酶是中国科学院化工冶金研究所生产的专利产品，其他原料均可在市场上购得。
应用本发明的方法，我们筛选了多种被筛选化合物，其中，发现了两种具有卓越抑制活性的化合物Y-14和Y-29，同样应用本发明乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，可通过灵敏度曲线得到抑制中浓度IC50值，这将在实施例11和12中介绍。
本发明的积极效果及优点1.用本筛选方法发现了离体活性与氯磺隆相近的化合物Y-14和Y-29，在用药量相同的情况下，氯磺隆抑制活性为59％，Y-14为52％，Y-29为42％。氯磺隆的IC50值(抑制活性为50％时的用药浓度)为72μM，Y-14的IC50值为66μM，Y-29的IC50值为151μM。
这两种结构新颖的化合物由于确定了是高效的ALS酶抑制剂，就是有前途的先导化合物，有可能在此基础上，经结构优化开发成新的高效除草剂。
2.分析速度快由于把植株体内的生化反应移到实验室的试管中进行，避开了现有整体实验的长过程，排除了传输，代谢等过程的干扰。因此，在4小时内，一个工作人员可筛选10—20个化合物，并计算出抑制活性。
3.样品用量少该筛选方法只用0.4毫克的被筛选化合物，即可给出筛选结果结果。这将对那些合成反应产率低的化合物也可顺利进行评价，无需加大原料用量，也节约了开发费用。
4.适用范围广本方法提供了既能溶解样本，又不影响酶促反应和测定体系的四种溶剂，使难溶解的被筛选化合物也能溶解，同时，测定了同一被筛选化合物在不同溶剂体系下的抑制活性，其结果相近，说明方法可靠。
5.稳定性好，准确性好针对酶促反应特点，本发明提出了新的空白概念，它不同于通常理解的“试剂空白”概念。新的空白概念是，酶在无酶反应物的酶反应条件下，进行的酶促反应的产物为空白。设计程序扣除了这部份空白，因此计算值能准确地反映抑制剂的抑制活性。
方法设计中，考虑了各种影响稳定性，准确性的因素，诸如底物浓度值，溶液pH值的控制，脱羧时硫酸用量等等，通过大量实验，确定了操作条件。测量方法采用分光光度法，设计了独特的操作程序。①考虑了溶剂本身引起的光密度值变化，选用相同溶剂，相同用量下进行比较，因此可抵消溶剂效应造成的误差，②可抵消系统误差，因此，最终的测量结果好于一般的生测方法，相对误差不大于3-5％。
6.灵敏度高做为催化反应速率依据的产物检出下限为0.2微克，可测化合物的抑制活性范围为0-100％。
本发明经过大量实验，提供以下曲线图图1.络合物的光吸收曲线；图2.反应速率E与溶液pH值的关系曲线；
图3.酶用量对光密度E值关系曲线；图4.反应速率E与底物浓度的关系曲线；图5.反应产物脱羧时加硫酸用量的关系曲线；图6.反应产物测定时E与0.5％肌酸用量的关系曲线；图7.反应产物测定时E与5％1-碱萘酚用量的关系曲线；图8.反应产物测定时E与溶液显色反应温度的关系曲线；图9.反应产物测定时E与络合物稳定时间的关系曲线；图10.标准物3-羟基丁酮的工作曲线；图11.化合物TP的灵敏度曲线；图12.化合物氯磺隆的灵敏度曲线；图13.化合物甲磺隆的灵敏度曲线；图14.化合物Y-14的灵敏度曲线；图15.化合物Y-29的灵敏度曲线。
以下结合实施例和附图，对本发明作进一步介绍。
实施例1化合物氯磺隆的筛选验证实验(1)首先选用比活值为5-12μM/mg.hr的0.2-0.5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2)能够完全溶解被筛选的氯磺隆化合物的溶剂是二甲亚砜，将10mg的氯磺隆样本溶解在5ml二甲亚砜溶剂中，配制成浓度为2mg/ml的溶液。
(3)酶促反应的反应物中所用底物，辅酶和缓冲溶液的组成和浓度如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底 物丙酮酸钠CH3·CO·COOH 15.5mM辅 酶氯化镁MgCl20.4mM
硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM(4)按照表1的筛选方法程序，准备四个试管，向每个试管加入0.5ml酶，0.6ml 20mM的K2HPO4配成酶促反应液。
表1.ALS酶抑制剂筛选方法程序模型(双平行)1 23项目 被筛选物 K2HPO4反应物酶H2O 39-40℃20mM试管 (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (分)#1 溶剂0.10.6 0.0 0.5 1.460#2 溶剂0.10.6 1.0 0.5 0.460#3 样本0.10.6 0.0 0.5 1.460#4 样本0.10.6 1.0 0.5 0.460表1. (续)4 5 6项目 H2SO459-60℃ 肌酸1-碱萘酚59-60℃ 室温放置E6N 0.5％5％ 520nm试管 (ml) (分) (ml)(ml)(分) (分)1cm皿#1 0.2 151.0 2.02035 EA#2 0.2 151.0 2.02035 EB#3 0.2 151.0 2.02035 EA1#4 0.2 151.0 2.02035 EB1表1中所列的六种溶液配制如下1.被筛选化合物溶液称10mg化合物溶于5ml的水，或丙酮，或二甲亚砜，或四氢呋喃中，浓度为2mg/ml；
2.K2HPO4溶液称0.4564g K2HPO4·3H2O溶于100ml水中；3.反应物溶液①K2HPO4称0.9128g K2HPO4·3H2O溶于20ml水；②丙酮酸钠称0.4401g溶于20ml水；③氯化镁称0.0203g溶于10ml水；④TPP称0.0461g溶于10ml水；⑤FAD称1.659mg溶于10ml水；顺次将①，②，③，④，⑤倒入100ml容量瓶中，加水至刻度；4. 6N H2SO4溶液取浓H2SO416.7ml缓慢加入水中，至100ml；5. 0.5％肌酸称0.5g肌酸溶于水，至100ml；6. 5％1-碱萘酚称1.0g纯化的1-碱萘酚溶于2.5N的NaOH溶液至20ml。
再按以下I，II，III，IV四种情况配制在#1，#2试管中加入0.1ml的二甲亚砜溶剂而不加氯磺隆时I#1试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.2，此时进行无反应物的酶促反应，其产物量为空白。反应条件是在常压下，39-40℃，反应进行一小时，生成产物乙酰乳酸。按照测定酶促反应速率的方法，即分光光度法测该产物的含量，依次包括如下步骤①向2.6ml的酶促反应溶液中，加入0.2ml 6N的H2SO4，停止反应并将乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮；②将上述溶液在59-60℃下恒温15分钟；③加入1ml 0.5％的肌酸；④再加入2ml 5％的1-碱萘酚，组成5.8ml的测定溶液，即红色络和物溶液；⑤在59-60℃，常压下恒温20分钟；
⑥取出试管，摇匀后，室温静置35分钟；⑦用分光光度计检测，波长为520nm，用1cm比色皿比色，测产物的光密度值EA＝0.429。为获得准确值，照上述方法做平行实验，得EA＝0.433，取其平均值，EA＝0.431，见表2。
II#2试管中加入(3)所述的反应液1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.3，此时进行有反应物的酶促反应，其反应条件与测产物含量的步骤与I相同，测出平均值EB＝0.912，见表2。
在#3，#4试管中加入0.1ml的(2)所述的氯磺隆化合物溶液后III#3试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.3，此时进行有氯磺隆存在下的，无反应物的酶促反应空白实验。其反应条件与测产物含量的步骤与I相同，测出平均值EA1＝0.439，见表2。
IV#4试管中加入(3)所述的反应物1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.4，其它与上述测定步骤相同，测出加入反应物后酶促反应物数量，取其平均值EB1＝0.636，见表2。
(5)确定乙酰乳酸合成酶的活性E0EO＝EB－EA＝0.912－0.431＝0.481(6)乙酰乳酸合成酶在有氯磺隆存在时的残余活性E1E1＝EB1－EA1＝0.635－0.439＝0.197(7)计算氯磺隆的抑制活性i％i%=(1-E1E0)×100%=(1-0.1970.481)×100%=59%]]>因氯磺隆是已知的高效ALS酶抑制剂，由此结果可验证本发明方法的可行性及可靠性。
表2.实施例1-7的测定数据表(各被筛选物样本均为10mg)实施例号 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7被筛选物 氯磺隆 甲磺隆 TP Y-14 R-2Li-2 Lu-5分子量357.3 381.4 302.0 438.0 305.3 332.0 394.0浓度μM 96.590.4114.0 78.0 112.0 103.0 87.0二甲四氢二甲二甲 四氢溶剂 亚砜呋喃亚砜亚砜 呋喃 水 丙酮EA(单次) 0.429 0.660 0.628 0.665 0.660 0.367 0.3940.433 0.664 0.618 0.657 0.664 0.364 0.392EA(平均) 0.431 0.662 0.623 0.661 0.662 0.365 0.393EB(单次) 0.908 0.885 1.067 1.088 0.885 0.890 0.6990.916 0.894 1.095 0.999 0.894 0.872 0.690EB(平均) 0.912 0.889 1.081 1.004 0.889 0.881 0.694E0＝EB－EA0.481 0.227 0.458 0.343 0.227 0.516 0.301EA1(单次) 0.431 0.663 0.628 0.660 0.655 0.364 0.4020.446 0.667 0.626 0.668 0.665 0.368 0.396EA1(平均) 0.439 0.665 0.627 0.664 0.660 0.366 0.399EB1(单次) 0.635 0.760 0.798 0.828 0.851 0.889 0.6950.636 0.768 0.806 0.829 0.867 0.875 0.675EB1(平均) 0.636 0.764 0.802 0.828 0.859 0.882 0.685E1＝EB1－EA1 0.197 0.099 0.175 0.164 0.199 0.516 0.286抑制活性％59 56 62 52 12 0 5实施例2化合物甲磺隆的筛选验证实验(1)首先选用比活值为5-12μM/mg.hr的0.2-0.5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2)能够完全溶解被筛选的甲磺隆化合物的溶剂是四氢呋喃，将10mg的甲磺隆样本溶解在5ml四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为2mg/ml的溶液。
(3)酶促反应的反应物中所用底物，辅酶和缓冲溶液的组成和浓度如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底物丙酮酸钠CH3·CO·COOH 15.5mM辅酶氯化镁MgCl20.4mM硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM(4)按照表1的筛选方法程序，准备四个试管，向每个试管加入0.5ml酶，0.6ml 20mM的K2HPO4配成酶促反应液。再按以下四种情况配制在#1，#2试管中加入0.1ml的四氢呋喃溶剂而不加甲磺隆时I#1试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为6.9，此时进行无反应物的酶促反应，其产物量为空白。反应条件是在常压下，39-40℃，反应进行一小时，生成产物乙酰乳酸。按照测定酶促反应速率的方法，即分光光度法测该产物的含量，依次包括如下步骤①向2.6ml的酶促反应溶液中，加入0.2ml 6N的H2SO4，停止反应并将乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮；②将上述溶液在59-60℃下恒温15分钟；③加入1ml 0.5％的肌酸；④再加入2ml 5％的1-碱萘酚，组成5.8ml的测定溶液，即红色络和物溶液；⑤在59-60℃，常压下恒温20分钟；⑥取出试管，摇匀后，室温静置35分钟；⑦用分光光度计检测，波长为520nm，用1cm比色皿比色，测产物的光密度值EA＝0.660。为获得准确值，照上述方法做平行实验，得EA＝0.664，取其平均值，EA＝0.662，见表2。
II#2试管中加入(3)所述的反应液1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.0，此时进行有反应物的酶促反应，其反应条件与测产物含量的步骤与I相同，测出平均值EB＝0.889，见表2。
在#3，#4试管中加入0.1ml的(2)所述的甲磺隆化合物溶液后III#3试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.0，此时进行有甲磺隆存在下的，无反应物的酶促反应空白实验。其反应条件与测产物含量的步骤与1相同，测出平均值EA1＝0.665，见表2。
IV#4试管中加入(3)所述的反应物1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.1，其它与上述测定步骤相同，测出加入反应物后酶促反应物数量，取其平均值EB1＝0.764，见表2。
(5)确定乙酰乳酸合成酶的活性EOE0＝EB－EA＝0.889－0.662＝0.227(6)乙酰乳酸合成酶在有甲磺隆存在时的残余活性E1E1＝EB1－EA1＝0.764－0.665＝0.099(7)计算甲磺隆的抑制活性i％i%=(1-E1E0)×100%=(1-0.0990.227)×100%=56%]]>因甲磺隆是已知的高效ALS酶抑制剂，由此结果亦可验证本发明方法的可行性及可靠性。
实施例3化合物三唑并嘧啶衍生物TP的筛选验证实验(1)首先选用比活值为5-12μM/mg.hr的0.2-0.5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2)能够完全溶解被筛选化合物的溶剂是二甲亚砜，将10mg的TP样本溶解在5ml二甲亚砜溶剂中，配制成浓度为2mg/ml的溶液。
(3)酶促反应的反应物中所用底物，辅酶和缓冲溶液的组成和浓度如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底物丙酮酸钠CH3·CO·COOH 15.5mM辅酶氯化镁MgCl20.4mM硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM(4)按照表1的筛选方法程序，准备四个试管，向每个试管加入0.5ml酶，0.6ml 20mM的K2HPO4配成酶促反应液。再按以下四种情况配制在#1，#2试管中加入0.1ml的二甲亚矾溶剂而不加TP时I#1试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.5，此时进行无反应物的酶促反应，其产物量为空白。反应条件是在常压下，39-40℃，反应进行一小时，生成产物乙酰乳酸。按照测定酶促反应速率的方法，即分光光度法测该产物的含量，依次包括如下步骤①向2.6ml的酶促反应溶液中，加入0.2ml 6N的H2SO4，停止反应并将乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮；②将上述溶液在59-60℃下恒温15分钟；③加入1ml 0.5％的肌酸；④再加入2ml 5％的1-碱萘酚，组成5.8ml的测定溶液，即红色络和物溶液；⑤在59-60℃，常压下恒温20分钟；⑥取出试管，摇匀后，室温静置35分钟；⑦用分光光度计检测，波长为520nm，用1cm比色皿比色，测产物的光密度值EA＝0.628。为获得准确值，照上述方法做平行实验，得EA＝0.618，取其平均值，EA＝0.623，见表2。
II#2试管中加入(3)所述的反应液1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.4，此时进行有反应物的酶促反应，其反应条件与测产物含量的步骤与I相同，测出平均值EB＝1.081，见表2。
在#3，#4试管中加入0.1ml的(2)所述的TP化合物溶液后III#3试管中加入1.4ml的水，将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.5，此时进行有TP存在下的，无反应物的酶促反应空白实验。其反应条件与测产物含量的步骤与I相同，测出平均值EA1＝0.627，见表2。
IV#4试管中加入(3)所述的反应物1.0ml，再加入0.4ml的水，同样将溶液体积配至2.6ml，实测pH值为7.4，其它与上述测定步骤相同，测出加入反应物后酶促反应物数量，取其平均值EB1＝0.802，见表2。
(5)确定乙酰乳酸合成酶的活性EOE0＝EB－EA＝1.081－0.623＝0.458(6)乙酰乳酸合成酶在有TP存在时的残余活性E1E1＝EB1－EA1＝0.802－0.627＝0.175(7)计算TP的抑制活性i％i%=(1-E1E0)×100%=(1-0.1750.458)×100%=62%]]>因TP是已知的高效ALS酶抑制剂，由此结果亦可验证本发明方法的可行性及可靠性。
实施例4人工合成化合物Y-14的筛选取10mg的Y-14溶解在5ml二甲亚砜溶剂中，配制成浓度为2mg/ml的Y-14溶液。按照与实施例1相同的步骤，加入相同的反应物和在相同的条件下，进行酶促反应，测定酶促反应速率时，加入的溶液分别是0.05ml 6N的H2SO4，1.5ml 0.5％的肌酸，1ml 5％的1-碱萘酚；加水至5.80ml的测定溶液，络和物静置时间为30分钟。四种情况下反应产物的光密度值见表2所示，其抑制活性i％＝52％。
实施例5人工合成化合物R-2的筛选取10mg的R-2溶解在5ml四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为2mg/ml的R-2溶液。按照与实施例1相同的步骤，加入相同的反应物和在相同的条件下，进行酶促反应，测定酶促反应速率时，加入的溶液分别是0.05ml 6N的H2SO4，0.5ml 0.5％的肌酸，1ml 5％的1-碱萘酚；加水至5.80ml的测定溶液，络和物静置时间为30分钟。四种情况下反应产物的光密度值见表2所示，其抑制活性i％＝12％。
实施例6人工合成化合物Li-2的筛选取10mg的Li-2溶解在5ml水中，配制成浓度为2mg/ml的Li-2溶液。按照与实施例1相同的步骤，加入相同的反应物和在相同的条件下，进行酶促反应，测定酶促反应速率时，加入的溶液分别是0.25ml 6N的H2SO4，0.5ml0.5％的肌酸，1.5ml 5％的1-碱萘酚；加水至5.80ml的测定溶液，络和物静置时间为30分钟。四种情况下反应产物的光密度值见表2所示，其抑制活性i％＝0％，说明Li-2化合物没有抑制活性。
实施例7人工合成化合物Lu-5的筛选取10mg的Lu-5溶解在5ml丙酮中，配制成浓度为2mg/ml的Lu-5溶液。以下完全按照实施例1方法进行测定。所得四种情况下反应产物的光密度值见表2所示，其抑制活性i％＝5％，说明化合物Lu-5仅有微弱的抑制活性。
实施例8确定化合物TP的IC50值1.按照表1的筛选方法程序，按照实施例1的方法进行，首先测定没有反应物时，按表3列顺序依次加入0.1ml的二甲亚矾溶剂，0.6ml 20mM的K2HPO4，0.5ml的ALS酶，1.4ml的水，配制成2.6ml的反应液，在39-40℃下恒温进行酶促反应一小时，用分光度法测酶促反应速率，即加0.2ml 6N的H2SO4，59-60℃下恒温15分钟，加1ml 0.5％的肌酸，加2ml 5％的1-碱萘酚，59-60℃下恒温20分钟，室温放置35分钟，在520nM，用1cm比色皿测空白产物量EAl值为0.627，见表3。
表3.实施例8(TP)的参数和测定数据表试反应 K2HPO4反应 酶 H2O 39- H2SO459-肌酸管浓度 20mM液 40℃ 6N 60℃ 0.5％号(μM) (ml) (ml) (ml) (ml) (分)(ml) (分) (ml)0 0.1ml溶剂 0.6 0 0.5 1.4 600.2 15 1.01 0 0.6 1.00.5 0.4 600.2 15 1.02 57.09 0.6 1.00.5 0.4 600.2 15 1.03 114.18 0.6 1.00.5 0.4 600.2 15 1.04 171.27 0.6 1.00.5 0.4 600.2 15 1.05 228.36 0.6 1.00.5 0.4 600.2 15 1.0表3. (续)试1-碱萘酚 59- 室温 E 残活管5％ 60℃ 放置号(ml) (分) (分) (520nm，1cm) (％)0 2.0 2035 EA1＝0.6271 2.0 2035 EB0＝1.085 EO＝EB0－EA1＝0.458 1002 2.0 2035 EB1＝0.848 E1＝EB1－EA1＝0.221 483 2.0 2035 EB2＝0.802 E2＝EB1－EA1＝0.175 384 2.0 2035 EB3＝0.778 E3＝EB1－EA1＝0.151 325 2.0 2035 EB4＝0.744 E4＝EB1－EA1＝0.117 25按照上述方法，再测定TP在五种不同浓度情况下的酶促反应产物量EB值，EB0，EB1，EB2，EB3，EB4分别为1.085，0.848，0.802，0.778，和0.744。它们与EA1(0.627)的差E0，1，2，3，4分别为0.458，0.221，0.175，0.151，和0.117。其对应的TP浓度分别为0μM，57.09μM，114.18μM，171.27μM，和228.36μM，见表3。
2.用残余活性百分数公式r%=EO,1,2,3,4EO×100%]]>计算出TP在五种浓度下的残余活性百分数，依次分别为100％，48％，38％，32％，和25％。
3.用TP的浓度值为横坐标，用对应的残余活性百分数r％为纵坐标，绘制灵敏度曲线，见图11。
4.从灵敏度曲线找出残余活性为50％时所对应的TP的浓度值为57μM，即为TP的抑制中浓度IC50值。
实施例9确定化合物氯磺隆的IC50值1.按照表1的筛选方法程序，按照实施例1的方法进行，首先测定没有反应物时，按下列顺序依次加入0.1m的二甲亚砜溶剂，0.6ml 20mM的K2HPO4，0.5ml的ALS酶，1.4ml的水，配制成2.6ml的反应液，在39-40℃下恒温进行酶促反应一小时，用分光度法测酶促反应速率，即加0.2ml 6N的H2SO4，59-60℃下恒温15分钟，加1ml 0.5％的肌酸，加2ml 5％的1-碱萘酚，59-60℃下恒温20分钟，室温放置35分钟，在520nM，用1cm比色皿测空白产物量EA1值为0.458。
按照上述方法，再测定氯磺隆在五种不同浓度情况下的酶促反应产物量EB值，EB0，EB1，EB2，EB3，EB4分别为0.839，0.687，0.635，0.592，和0.553。它们与EA1(0.458)的差E0，1，2，3，4分别为0.381，0.229，0.177，0.134，和0.095。其对应的氯磺隆浓度分别为0μM，48.25μM，96.50μM，144.75μM，和193.00μM。
2.用残余活性百分数公式r%=EO,1,2,3,4EO×100%]]>计算出氯磺隆在五种浓度下的残余活性百分数，依次分别为100％，60％，46％，35％，和24％。
3.用氯磺隆的浓度值为横坐标，用对应的残余活性百分数r％为纵坐标，绘制灵敏度曲线，见图12。
4.从灵敏度曲线找出残余活性为50％时所对应的氯磺隆的浓度值为72μM，即为氯磺隆的抑制中浓度IC50值。
实施例10确定化合物甲磺隆的IC50值1.按照表1的筛选方法程序，按照实施例1的方法进行，首先测定没有反应物时，按下列顺序依次加入0.1ml的二甲亚砜溶剂，0.6ml 20mM的K2HPO4，0.5ml的ALS酶，1.4ml的水，配制成2.6ml的反应液，在39-40℃下恒温进行酶促反应一小时，用分光度法测酶促反应速率，即加0.2ml 6N的H2SO4，59-60℃下恒温15分钟，加1ml 0.5％的肌酸，加2ml 5％的1-碱萘酚，59-60℃下恒温20分钟，室温放置35分钟，在520nM，用1cm比色皿测空白产物量EA1值为0.683。
按照上述方法，再测定甲磺隆在五种不同浓度情况下的酶促反应产物量EB值，EB0，EB1，EB2，EB3，EB4分别为0.938，0.835，0.782，0.742，和0.740。它们与EA1(0.683)的差E0，1，2，3，4分别为0.255，0.152，0.099，0.059，和0.057。其对应的甲磺隆浓度分别为0μM，45.20μM，90.40μM，135.60μM，和180.80μM。
2.用残余活性百分数公式r%=EO,1,2,3,4EO×100%]]>计算出甲磺隆在五种浓度下的残余活性百分数，依次分别为100％，59％，38％，23％，和22％。
3.用甲磺隆的浓度值为横坐标，用对应的残余活性百分数r％为纵坐标，绘制灵敏度曲线，见图13。
4.从灵敏度曲线找出残余活性为50％时所对应的甲磺隆的浓度值为58μM，即为甲磺隆的抑制中浓度IC50值。
实施例11确定先导化合物Y-14的IC50值
1.按照表1的筛选方法程序，按照实施例1的方法进行，首先测定没有反应物时，按下列顺序依次加入0.1ml的二甲亚砜溶剂，0.6ml 20mM的K2HPO4，0.5ml的ALS酶，1.4ml的水，配制成2.6ml的反应液，在39-40℃下恒温进行酶促反应一小时，用分光度法测酶促反应速率，即加0.2ml 6N的H2SO4，59-60℃下恒温15分钟，加1ml 0.5％的肌酸，加2ml 5％的1-碱萘酚，59-60℃下恒温20分钟，室温放置35分钟，在520nM，用1cm比色皿测空白产物量EA1值为0.664。
按照上述方法，再测定Y-14在五种不同浓度情况下的酶促反应产物量EB值，EB0，EB1，EB2，EB3，EB4分别为1.007，0.881，0.828，0.812，和0.716。它们与EA1(0.664)的差E0，1，2，3，4分别为0.343，0.217，0.164，0.148，和0.097。其对应的Y-14浓度分别为0μM，39.36μM，78.72μM，118.09μM，和157.44μM。
2.用残余活性百分数公式r%=EO,1,2,3,4EO×100%]]>计算出Y-14在五种浓度下的残余活性百分数，依次分别为100％，63％，47％，43％，和28％。
3.用Y-14的浓度值为横坐标，用对应的残余活性百分数r％为纵坐标，绘制灵敏度曲线，见图14。
4.从灵敏度曲线找出残余活性为50％时所对应的Y-14的浓度值为66μM，即为Y-14的抑制中浓度IC50值。
实施例12确定先导化合物Y-29的IC50值1.按照表1的筛选方法程序，按照实施例1的方法进行，首先测定没有反应物时，按下列顺序依次加入0.1ml的二甲亚砜溶剂，0.6ml 20mM的K2HPO4，0.5ml的ALS酶，1.4ml的水，配制成2.6ml的反应液，在39-40℃下恒温进行酶促反应一小时，用分光度法测酶促反应速率，即加0.2ml 6N的H2SO4，59-60℃下恒温15分钟，加1ml 0.5％的肌酸，加2ml 5％的1-碱萘酚，59-60℃下恒温20分钟，室温放置35分钟，在520nM，用1cm比色皿测空白产物量EA1值为0.628。
按照上述方法，再测定Y-29在五种不同浓度情况下的酶促反应产物量EB值，EB0，EB1，EB2，EB3，EB4分别为1.006，0.960，0.846，0.805，和0.754。它们与EA1(0.628)的差E0，1，2，3，4分别为0.378，0.332，0.218，0.177，和0.126。其对应的Y-29浓度分别为0μM，50.65μM，101.30μM，151.95μM，和202.60μM。
2.用残余活性百分数公式r%=EO,1,2,3,4EO×100%]]>计算出Y-29在五种浓度下的残余活性百分数，依次分别为100％，88％，58％，47％，和33％。
3.用Y-29的浓度值为横坐标，用对应的残余活性百分数r％为纵坐标，绘制灵敏度曲线，见图15。
4.从灵敏度曲线找出残余活性为50％时所对应的Y-29的浓度值为151μM，即为Y-29的抑制中浓度IC50值。
权利要求
1.乙酰乳酸合成酶(ALS酶)抑制剂筛选方法，其特征在于选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由乙酰乳酸合成酶的底物，辅酶，和缓冲液配制而成，反应过程为测定反应体系中不含被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的，被抑制的酶促反应速率V1，根据二者比值，确定抑制活性百分数i％，其公式为i%=(1-V1V0)×100%---(1)]]>反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式(1)成为i%=(1-E1E0)×100%---(2)]]>根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤(1).首先选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制其溶液；(3).确定进行酶促反应的反应物中底物，辅酶，和缓冲溶液的组成及浓度；(4).在有酶，水，和缓冲溶液配成的反应液中，再按以下四种情况(I，II，III，IV)加入不同的物质进行酶促反应，分别测出四种情况下的产物量E值；在反应液中加入溶解被筛选物的溶剂而不加被筛选物时I.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA；II.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB；在反应液中加入被筛选物溶液后III.测定反应液中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA1；IV.测定反应液中加入反应物后的酶促反应产物量EB1；(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物时的酶促反应产物量EA之差，该值表达式E0＝EB－EA(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的残余活性E1.该值表达式E1＝EB1-EA1(7).根据权利要求1中的公式(2)，计算被筛选物的抑制活性。
2.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的乙酰乳酸合成酶酶促反应空白产物系指乙酰乳酸合成酶在无(外加)酶反应物的酶反应条件下，仍不断进行酶促反应，产生的产物为空白。
3.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的乙酰乳酸合成酶酶的比活值为5-12μM/mg·hr，酶促反应的反应物中底物，辅酶，和缓冲溶液的组成及浓度和酶促反应的条件及产物如下缓冲液磷酸氢二钾K2HPO420mM底物丙酮酸钠CH3·CO·COOH 15.5mM辅酶氯化镁MgCl20.4mM硫胺素焦磷酸TPP 0.4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM 在上述反应物中加入0.1ml的溶剂和0.5ml的酶，配制成2.6ml的反应溶液，在常压，39—40℃下，进行一小时酶促反应，生成产物乙酰乳酸。
4.根据权利要求3所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的乙酰乳酸合成酶酶促反应溶液的最佳pH值在6.9—7.5。
5.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的测定乙酰乳酸合成酶酶促反应产物乙酰乳酸的方法用测酶活的方法。
6.根据权利要求5所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的测酶活的方法可用分光光度法，系测定乙酰乳酸在硫酸作用下转化为3-羟基丁酮的含量，反应过程为分光光度法依次包括如下步骤(1).向2.6ml的酶促反应溶液中加入0.05—0.25ml，6N的H2SO4；(2).将上述溶液在59—60℃下恒温15分钟；(3).加入0.5—1.5ml，0.5％的肌酸(一种含胍基化合物)；(4).再加入1—2ml，5％的1-碱萘酚，生成红色络合物；(5).测定溶液体积为3—7ml；在59—60℃，常压下恒温20分钟；(6).取出溶液，摇匀后静置30—40分钟；(7).用分光光度仪测定E值，波长为520nm，1cm比色皿。
7.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的溶解被筛选物的溶剂可选用水体系。
8.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的溶解被筛选物的溶剂可选用丙酮体系。
9.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的溶解被筛选物的溶剂可选用四氢呋喃体系。
10.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于所述的溶解被筛选物的溶剂可选用二甲亚砜体系。
11.根据权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，可用于确定被筛选抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值，据此确定创制新农药时的先导化合物，其确定步骤如下(1).选用不同浓度的同一种抑制剂，按权利要求1所述的方法，分别同时进行酶促反应；(2).根据酶促反应结果，得到不同浓度时对应的酶活值，进而，确定同一抑制剂在不同浓度时的残余活性百分数，即100％-i％；(3).用抑制剂的浓度及所对应的残余活性百分数为坐标，绘制灵敏度曲线；(4).根据曲线找出残余活性为50％时，也就是抑制活性i％为50％时所对应的浓度，即为该抑制剂的ALS酶抑制中浓度IC50值，据此确定创制新农药时的先导化合物。
全文摘要
本发明涉及乙酰乳酸合成酶(ALS酶)抑制剂筛选方法和应用。被筛选物参与试管中的ALS酶的酶促反应，如果它是该酶抑制剂，则反应速率下降，产物减少，通过测定反应产物的转化物，快速准确地得出酶的活性和化合物的抑制活性，从而实现ALS酶抑制剂的筛选。提出了新的空白概念和最佳的pH范围，建立了四种溶剂体系，可溶解各类送检样本，检测了各类化合物及其衍生物，发现了开发高效除草剂的先导化合物，给出了ALS酶抑制中浓度IC
文档编号C12Q1/26GK1119214SQ9510982
公开日1996年3月27日 申请日期1995年8月29日 优先权日1995年8月29日
发明者曹殿芳, 周家驹, 骆元章 申请人:中国科学院化工冶金研究所