专利名称：一种新的人红细胞生成素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人红细胞生成素技术领域，具体地说是一种人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中表达的方法。
红细胞生成素(Erythropoietin，FPO)是一种重要的造血生长因子，在体内，它可以特异性地刺激骨髓中红细胞前体细胞的增殖、分化，增加成熟的红细胞从骨髓向外周血中的释放量。肾脏是成年人体内红细胞生成素的主要产生部位，因肾衰竭引起的红细胞生成素的产生减少会导致贫血。临床上已经将红细胞生成素用于治疗肾衰竭引起的贫血、AIDS病人因齐多夫定治疗所致贫血以及肿瘤病人因化疗所致的贫血，在手术及骨髓移植中，红细胞生成素也得到较好的应用。经红细胞生成素治疗后，病人体内红细胞压积及血红蛋白水平明显升高，对输血的依赖性明显降低，因此，红细胞生成素的临床应用前景十分广阔。
天然人红细胞生成素主要是从贫血病人的血液或尿中提取，因其来源十分有限，无法满足临床及科研的大量需求。重组DNA技术的发展，为大量生产人红细胞生成素提供了一条新的途径。1985年以来，已有许多学者成功地在哺乳动物细胞中表达了人红细胞生成素(Fu-kuen，Lin等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，827580-7584,1985；Kenneth Jacobs等，Nature，313806-810，1985；Jerry S.Powell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，836465-6469，1986；黄利文等，中国科学B辑，24178-184，1994)。这些在哺乳动物细胞中表达的基因工程人红细胞生成素具有与天然人红细胞生成素相同的体内、体外活性。目前基因工程人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中的表达主要遵循如下方法。
1.编码人红细胞生成素的DNA片段的获得主要有两种方式获得编码人红细胞生成素的DNA片段。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后进行体外拼接。另一种是提取人胎肝mRNA，经逆转录合成cDNA文库。或是筛选人胎肝基因组文库，得到编码人红细胞生成素的基因，切下人红细胞生成素基因与表达载体相连接，导入哺乳动物细胞，提取mRNA，再逆转录成cDNA文库。筛选cDNA文库，得到编码人红细胞生成素的DNA片段。
2.编码人红细胞生成素的DNA片段与表达载体相连接。常用的表达载体有pDSVL、pSV2，这两种质粒带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，也可以用pD11，不含dhfr基因。
3、细胞株的构建将重组质粒导入哺乳动物细胞，经筛选得到所需要的细胞株。常用的宿主细胞为COS细胞及CHO细胞。
根据已发表的文献，中国人红细胞生成素的基因组成与结构以及红细胞生成素的氨基酸序列与国外发表的文献相同。EPO基因编码区可编码193个氨基酸，其中前27个氨基酸组成前导信号肽，其余166个氨基酸组成成熟蛋白，其分子量为18399D。重组EPO分子因糖基化程度及糖型组成不同，其分子量从26KD到34KD不等。
本发明提供了一种新的人红细胞生成素及其生产方法，该生产方法包括重组DNA载体的构建，将重组载体DNA转染哺乳动物细胞，培养细胞，从上清中纯化得到一种新的人红细胞生成素。
本发明还提供了一种编码人红细胞生成素的新的DNA分子。该DNA分子的第217位碱基为C，已发表的文献为G。
本发明还提供了一种新的人红细胞生成素的氨基酸组成序列。该序列由193个氨基酸组成，其中前27个氨基酸组成信号肽，后166个氨基酸组成成熟蛋白，成熟蛋白的第46位氨基酸为Leu，而不是Val。经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表观分子量为30～32KD，为一糖蛋白。本发明的人红细胞生成素的衍生物也包括在本发明中。
本发明还提供了一种重组DNA分子。将编码人红细胞生成素的DNA片段与表达载体pCRⅢ相连接，得到重组质粒pE/C。
本发明还提供了用于表达人红细胞生成素的哺乳动物细胞。将质粒pE/C与pDHFR共转染中国仓鼠卵巢细胞，得到表达重组人红细胞生成素的工程细胞株，其表达量超过10000U/ml·106细胞，为现有细胞株表达量的2～3倍。
本发明还提供了含有一种新的人红细胞生成素及其衍生物的药品，在该药品中本发明的红细胞生成素及其衍生物作为药品的全部或部分活性组份。
本发明还提供了一种将新的人红细胞生成素用于疾病治疗的方法，含有这种新的人细胞生成素的药品可用于治疗肾衰竭性贫血，肿瘤化疗所致贫血，还用作骨髓移植增强剂。实现本发明的技术要点是1.从新鲜的中国人胎肝中提取总RNA，经逆转录合成cDNA的第一链，再经聚合酶链反应(PCR)扩增出编码中国人红细胞生成素的DNA片段。
2.将扩增的DNA产物与表达载体pCRIII相连接，连接产物用于转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，经筛选、鉴定，得到重组分子pE/C。
3.采用United States Biochemical，Inc.测序酶试剂盒测定质粒pE/C中编码中国人红细胞生成素的DNA片段的序列。测序结果表明编码区第217位碱基为C，由此推导成熟蛋白的第46位氨基酸为Leu。
4.将重组质粒pE/C与质粒pDHFR(购自Invitrogen)采用脂质转染法共转染二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)，在浓度不断增加的氨甲蝶呤(MTX)中加压筛选，最后经酶联免疫分析确认所得到的细胞株。
下面通过实施例对本发明作进一步说明1.重组质粒pE/C的构建从1克中国人胎肝中提取总RNA，1.2％琼脂糖电泳表明18S及28S RNA完整。取5ug总RNA为模板，以禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)合成cDNA的第一链，将此合成产物按1∶10稀释取1ul作为模板，以特异性寡核苷酸作为3’-端及5’-端引物，以Tag酶作为DNA聚合酶，经聚合酶链反应(PCR)扩增出编码中国人红细胞生成素的DNA片段。PCR反应条件为95℃变性10分钟，循环阶段95℃变性45秒，56℃退火50秒，72℃延伸2分钟，35个循环后在72℃延伸10分钟。PCR产物经1％琼脂糖电泳显示扩增产物为630bp左右，与预期大小一致。从琼脂糖中回收630bp片段，与载体pCRIII在12℃连接过夜，连接酶为T4 DNA连接酶。连接产物用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单菌落接种于5ml培养基中，37℃培养过夜。小量制备质粒DNA，经EcORI消化，表明重组质粒含630bp片段，且插入方向正确。得到的质粒命名为pE/C，其结构见附
图1，其全序列见表1.。
表1.质粒pE/C的全DNA序列
* * * * *GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC100* * * * *TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT* * * * *GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG200* * * * *GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG* * * * *CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT GATTATTGAC300* * * * *TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA* * * * *TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG400* * * * *CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT* * * * *AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT500* * * * *AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC* * * * *CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC TAAATGGCCC GCCTGGCATT600* * * * *CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA* * * * *TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA700* * * * *TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA* * * * *TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA
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2.质粒pE/C中编码中国人红细胞生成素的DNA片段序列测定利用测序酶试剂盒(United States Biochemical，Inc.USA)，以变性双链DNA为模板，以α-35S-dATP为标记，采用Sanger双脱氧终止法测定了重组质粒pE/C中国人红细胞生成素编码区DNA序列，测定结果见表2.。
表2.质粒pE/C中编码中国人红细胞生成素的DNA片段的序列ATGGGGGTG CACGAATGTCCTGCCTGGCT GTGGCTTCTC CTGTCCCTGC TGTCGCTCCC TCTGGGCCTCCCAGTCCTGG GCGCCCCACC ACGCCTCATC TGTGACAGCC GAGTCCTGGAGAGGTACCTC TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATCACG ACGGGCTGTGCTGAACACTG CAGCTTGAAT GAGAATATCA CTGTCCCAGA CACCAAACTTAATTTCTATG CCTGGAAGAG GATGGAGGTC GGGCAGCAGG CCGTAGAAGTCTGGCAGGGC CTGGCCCTGC TGTCGGAAGC TGTCCTGCGG GGCCAGGCCCTGTTGGTCAA CTCTTCCCAG CCGTGGGAGC CCCTGCAGCT GCATGTGGATAAAGCCGTCA GTGGCCTTCG CAGCCTCACC ACTCTGCTTC GGGCTCTGCGAGCCCAGAAG GAAGCCATCT CCCCTCCAGA TGCGGCCTCA GCTGCTCCACTCCGAACAAT CACTGCTGAC ACTTTCCGCA AACTCTTCCG AGTCTACTCCAATTTCCTCC GGGGAAAGCT GAAGCTGTAC ACAGGGGAGG CCTGCAGGACAGGGGACAGA根据测定的DNA序列，推导出中国人红细胞生成素的成熟蛋白氨基酸组成序列见表3.。
表3.中国人红细胞生成素成熟蛋白的氨基酸组成序列APP RLICDSRVLE RYLLEAKEAENITTGCAEHC SLNENITVPD TKLNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEAVLRGQALLVN SSQPWEPLQL HVDKAVSGLR SLTTLLRALR AQKEAISPPDAASAAPLRTI TADTFRKLFR VYSNFLRGKL KLYTGEACRT GDR3.表达细胞株的构建宿主细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)，为二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-)。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长满至50～60％时，以无血清培养基淋洗细胞，加入由5ml无血清培养基、10ug pE/C、10ug pDHFR(见图2)，60ug lipofectin组成的转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10％胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10％胎牛血清的DMEM中培养，以胰酶消化细胞，按1∶5稀释，在培养基中加入MTX至终浓度为1nM，继续培养10～14天至抗性克隆出现。以胰酶消化抗性克隆培养出的细胞，1∶5稀释，随后按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX浓度渐次升高，筛选抗性克隆。将在含200nM MTX培养基中出现的抗性克隆培养于100mm培养皿中，按1∶500稀释，继续培养3-5天，直至细胞克隆直径达到2～4mm。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞能够表达人红细胞生成素。
图表说明图1.质粒pE/C的结构示意2.质粒pDHFR的结构示意图pE/C质粒结构CMV启动子209-864T7启动子865-883 PDHFR质粒结构SP6启动子138-1645人EPO基因890-1520腺病毒晚期启动子1-656SV40启动子2674-2799 三联前导序列657-945新霉素抗性基因2805-3599 多克隆位点956-1056SV40聚腺苷酸加尾3603-3812二氢叶酸还原酶基因1080-1678SV40聚腺苷酸加尾1856-201权利要求
1.种人红细胞生成素蛋白，其特征是(1)分子量30～32KD(2)肽链部分为APP RLICDSRVLE RYLLEAKEAENITTGCAEHC SLNENITVPD TKLNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEAVLRGQALLVN SSQPWEPLQL HVDKAVSGLR SLTTLLRALR AQKEAISPPDAASAAPLRTI TADTFRKLFR VYSNFLRGKL KLYTGEACRT GDR(3)第46位氨基酸残基为Leu(4)由CHO细胞表达，为一糖蛋白。
2.红细胞生成素蛋白的衍生物，其特征是由权利要求1中的全部或部分氨基酸序列组成，具有人红细胞生成素活性。
3.一种编码人红细胞生成素的DNA分子，其特征是(1)其全序列为 ATGGGGGTG CACGAATGTCCTGCCTGGCT GTGGCTTCTC CTGTCCCTGC TGTCGCTCCC TCTGGGCCTCCCAGTCCTGG GCGCCCCACC ACGCCTCATC TGTGACAGCC GAGTCCTGGAGAGGTACCTC TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATCACG ACGGGCTGTGCTGAACACTG CAGCTTGAAT GAGAATATCA CTGTCCCAGA CACCAAACTTAATTTCTATG CCTGGAAGAG GATGGAGGTC GGGCAGCAGG CCGTAGAAGTCTGGCAGGGC CTGGCCCTGC TGTCGGAAGC TGTCCTGCGG GGCCAGGCCCTGTTGGTCAA CTCTTCCCAG CCGTGGGAGC CCCTGCAGCT GCATGTGGATAAAGCCGTCA GTGGCCTTCG CAGCCTCACC ACTCTGCTTC GGGCTCTGCGAGCCCAGAAG GAAGCCATCT CCCCTCCAGA TGCGGCCTCA GCTGCTCCACTCCGAACAAT CACTGCTGAC ACTTTCCGCA AACTCTTCCG AGTCTACTCCAATTTCCTCC GGGGAAAGCT GAAGCTGTAC ACAGGGGAGG CCTGCAGGACAGGGGACAGA(2)第217位碱基为C
4.一种新的重组质粒pE/C，其特征是(1)该质粒由表1.中的6079个碱基组成(2)该质粒中第899-1477个碱基为权利要求3中的DNA分子(3)该质粒与质粒pDHFR共转染二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞，可用于表达权利要求1中的人红细胞生成素。这里的质粒pDHFR购自Invitrogen。
5.表达人红细胞生成素的基因工程细胞株，其特征是(1)由权利要求4中的质粒pE/C与质粒pDHFR共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞得到。这里的质粒pDHFR购自Invitrogen，中国仓鼠卵巢细胞购自美国菌种保藏中心。(2)经培养可以表达权利要求1中的人红细胞生成素。(3)该细胞株对权利要求1中的人红细胞生成素的表达量达到10000U/m1.106细胞。
6.一种具有人红细胞生成素活性的药品，其特征是权利要求1或2中的蛋白作为该药品的全部或部分活性组分。
全文摘要
一种人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中的表达方法，其特点是提取总RNA，经逆转录合成cDNA的第一链，然后经聚合酶链反应扩增出编码人红细胞生成素的DNA片段，将此DNA片段与表达载体pCRIII相连接，得到重组质粒pE/C，将pE/C与质粒pDHFR共转染二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，得到用于表达人红细胞生成素的细胞株。本发明的细胞株具有传代稳定、表达量高等特点。
文档编号C12N15/12GK1118008SQ9511017
公开日1996年3月6日 申请日期1995年4月14日 优先权日1995年4月14日
发明者娄丹, 徐莉萍, 邹钟诚 申请人:沈阳三生药业有限公司