专利名称：一种新的人血小板生成素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种血小板生成素(简称TPO)技术领域，具体地说是一种人血小板生成素的基因克隆及表达。
血小板是一种重要的血液成份，对受伤部位血凝块的形成起到关键作用。(T.P.McDonald等，Exp.Hematol，16201-205，1988)。血小板可释放生长因子及细胞因子，这些因子可促进伤口愈合，并具有其它功能。在病理条件下，如血小板缺乏，病人可能会由于血小板生成受到抑制而不能形成血凝块，从而导致因大量失血引起的致命危险。血小板缺乏在下列情况下很容易出现1)进行放疗或化疗的癌症病人；2)骨髓移植病人；3)再生障碍性贫血病人。
通常进行血小板输注以治疗血小板缺乏。然而，与大多数血液制品一样，用于输注的血小板货架寿命较短，同时血小板输注使病人面临着血源性致病原如乙型肝炎病毒或艾滋病毒感染的危险。
显然，刺激血小板缺乏病人的内源性血小板生成，同时减少病人对血小板输注的依赖性将是非常有益的。另外，对正在接受放疗及化疗的病人，用TPO改善及防止血小板缺乏更为安全，可以增加化疗的强度，产生更好的抗癌效果。
因此已有许多人致力于研究血小板产生的调控机制。血小板由巨核细胞产生，主要发现于骨髓中，而巨核细胞由原始干细胞经细胞分裂、分化、成熟而来。据信血小板的产生受谱系特异性的激素的调控。
虽然几种已知的造血生长因子如IL-3，IL-6，IL-11等可刺激巨核细胞形成及血小板产生，其中多数为非特异的，而血小板生成的调控机制尚不明确。30多年前已经有证据表明在血小板缺乏的动物和人的血浆及尿中含有促巨核细胞生成活性，其作用具有谱系特异性，且不同于已知的细胞因子，因为它们可以刺激巨核细胞的增殖、成熟，故将其命名为血小板生成素或巨核细胞集落刺激因子(Odell TT Jr等，Proc.Soc Exp Bio Med，108428，1961；de Gabriele G等，JHaematol 13210，1976)。
尽管付出了大量努力，人、犬及小鼠的TPO基因直到最近才克隆成功(Ronald等，Nature，369533-539，1994；S，Lok等，Nature，369565-568，1994；Bartley等，Cell，771117-1124，1994)。编码TPO的cDNA的鉴定及克隆因TPO受体的发现而加快。TPO受体于1990年发现，已被用于研究巨核细胞形成的调控机制，该受体为TPO的纯化及编码人及小鼠TPO的cDNA的克隆提供了基础。
人TPO cDNA是含1059个核苷酸的开放读框，编码了含353个氨基酸的一级翻译产物。氨基端的氨基酸序列高度疏水，为前导信号肽，成熟蛋白由332个氨基酸组成。TPO蛋白有两个区域，中间为一潜在的蛋白酶切位点。该氨基端序列在人、犬及小鼠中高度保守，并与红细胞生成素、γ－干扰素、及β－干扰素有一定同源性。羧基端区域则表现出较大的差异性。
人TPO蛋白在体外对巨核细胞的增殖及成熟具有谱系特异性的作用。另外，给小鼠注射后，显著地增加了循环血中血小板水平。
本
发明内容
本发明提供了编码人TPO的DNA序列，该序列包括编码人TPO蛋白的全序列及5’－端及3’－端的非翻译序列(见表1)。
本发明所提供的编码人TPO的cDNA序列与已发表序列有以下区别(见表2)
1.本发明所提供的DNA序列中的5’-端非编码区有163个碱基，其中第28个碱基为T，而已发表的序列中相应位置为C2.本发明的DNA序列中第189个碱基为C，而已发表的序列序列中相应位置为T。
3.本发明的DNA序列中第1194个碱基为G，而已发表的序列序列中相应位置为A。
4.本发明的DNA序列中的聚腺苷酸化位点为第1387个碱基，切点在1441个碱基。该切点距翻译终止信号223个核苷酸，而已发表的序列中切点距翻译终止信号497个核苷酸。本发明的DNA序列中3’-端非编码区有238个碱基。
本发明还提供了人TPO蛋白，其氨基酸组成序列见表1。由于本发明所提供的DNA序列与已发表的序列不同，导致两处氨基酸序列的改变(见表3)1.本发明所提供的氨基酸序列中第9个氨基酸(信号肽内)为丙氨酸(A)，而已发表的所有氨基酸序列中均为缬氨酸(V)2.本发明所提供的氨基酸序列中第347个氨基酸为精氨酸(R)，而已发表的所有序列中均为谷氨酰胺(Q)3.此外，本发明所提供之氨基酸序列中第113个氨基酸(谷氨酰胺，Q)与已发表的三个序列中两个相同，而与另外一个不同，该序列中相应位置上的氨基酸为谷氨酸(E)。
本发明也提供了TPO蛋白的衍生物。它包括表1中的全部或部分氨基酸序列组成的多肽或蛋白及其糖基化产物。
本发明也提供了含载体DNA及编码人TPO的DNA分子的重组DNA分子。该重组分子内，将编码人TPO的DNA分子序列与调控序列相连接，该调控序列可指导TPO基因在选定的宿主细胞内复制和表达。
本发明也提供了用于表达重组人TPO蛋白的以重组DNA分子转化的宿主细胞。
本发明还提供了以重组DNA分子及其转化的细胞生产重组人TPO蛋白或有其活性的部分肽链的方法。在该方法中，将编码TPO蛋白或有其活性的部分肽链的DNA分子与适当的控制TPO基因表达及调控的载体DNA相连接，用于转化细胞系，将转化的细胞系在合适的条件下培养，可以表达重组人TPO蛋白。表达的TPO蛋白可以采用各种手段从宿主细胞、细胞裂解物或培养基中得到。该方法适用于几种用于表达蛋白的宿主细胞。本发明中用于生产TPO的细胞系为哺乳动物细胞系、昆虫细胞系及细菌细胞。
本发明的另一个方面是将纯化的重组人TPO用作药品的活性成份。含有TPO的药品可用于治疗以血小板缺乏为特征的疾病，如血小板缺乏症、化疗所致血小板缺乏，还可用于骨髓移植的增强剂，加速骨髓移植后病人血小板的恢复。
本发明还提供了抗人TPO的抗体，分泌抗体的细胞系、抗体的生产方法及将抗人TPO抗体用于诊断及治疗的方法。
本发明的内容通过以下的实施例作具体说明例1.人胎肺cDNA文库的构建应用RNasol B(Tel-Test，Inc.，USA)从8个月胎儿肺组织中提取总RNA。应用Oligod Tex(Qiagen，USA)提取PolyA+RNA。使用Unizap II XR cDNA文库试剂盒(Strategen)构建cDNA文库。第一链cDNA以逆转录酶合成得到，第二链以RNA酶H及DNA聚合酶I合成得到。经XhoI消化后，cDNA按大小分离，随后连接到Unizap XR载体上，得到4×106个重组体。
例2.TPO cDNA克隆的分离合成下列寡核苷酸5’-CAGAATGGAGCTGACTGAATTG-3’5’-GCTGTACATGAGACAATGCTG-3’以同位素标记寡核苷酸，用作检测胎肺cDNA文库的探针。阳性克隆以放射标记的寡核苷酸杂交确认。得到阳性克隆T1。以T1克隆为模板，以下列与TPO基因编码区两端互补的寡核苷酸5’-CAGAATGGAGCTGACTGAATTG-3’5’-GCTGTACATGAGACAATGCTG-3’为引物，经PCR反应得到了一个1.1kb的产物。又经限制内切酶谱分析确认T1克隆含有TPO基因。
例3.T1克隆的序列分析应用测序酶试剂盒(United State Biochemical，Inc.，USA)测定了T1克隆的全序列，测定结果及相应的氨基酸序列见表1.
例4.重组TPO在大肠杆菌(E.coli.)中的克隆及表达构建了两个重组DNA用于在E.coli.中表达重组TPO。其中一个带有6-His标记。以T1克隆的DNA为模板，经PCR反应扩增编码TPO成熟蛋白的片段。对6-His标记的重组体，寡核苷酸引物为5’-AAAGCATGCGCCCGGCTCCTCCTGCT-3’5’-CCCAGATCTCCCTTCCTGAGACAGATT-3’含SphI及BamHI识别位点。对未标记的重组体，寡核苷酸引物为5’-AAAGCATGCGCCCGGCTCCTCCTGCT-3’5’-AAAAAGCTTACCCTTCCTGAGACAG-3’含SphI及HindIII识别位点。编码区DNA分子与表达载体pQE70(Qiagen)相连接。对组氨酸标记重组体，使TPO编码序列与组氨酸编码序列同方向插入，且使组氨酸与TPO的C-端相连。得到重组体pTPO-1，见
图1；未经标记的重组体为pTPO-2，见图2。连接混合物用于转化E.coli细胞系(Qiagen，商标为M15/rep4)M15/rep4含多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达1acI抑制物并表现卡那霉素(kan)抗性。含TPO基因的转化菌在含Amp(100ug/ml)及Kan(25ug/ml)的LB培养基中培养过夜，再接种于大量培养基中，继续培养至O.D.600＝0.6。加入IPTG至终浓度为1mM诱导TPO表达。继续培养3小时，表达产物经SDS-PAGE分析。
例5.TPO在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中的克隆及表达在CHO细胞中的表达载体有如下特点1)有氨苄青霉素(Amp)抗性基因；2)E.coli.复制起始；3)CMV-RSV启动子，后跟BamHI及PvuII克隆位点，一个SV40内含子及聚腺苷酸化位点；4)小鼠二氢叶酸还原酶(mDHFR)基因，该基因表现氨甲蝶呤(MTX)抗性。DHFE基因转录在SV40启动子控制下。编码TPO的DNA序列由T1克隆的DNA经PCR反应得到，5’-端引物为5’-CCCAGATCTGCCAGAATGGAGCTGAC-3’含BglII位点。3’-端引物为5-AAAGATATCTTACCCTTCCTGAGACAG-3’含EcoRV位点及终止密码子的互补序列。PCR产物经BglII及EcoRV消化，载体经BamHII及PvuII消化，然后连接。连接混合物用于转化大肠杆菌(E.coli.)系XLI Blue。转化液涂于氨苄青霉素盘上，挑选抗性克隆。得到重组DNA分子pTPO-3，见图3。
pTPO-3以脂质转染法导入CHO细胞，并在含0.02μM-0.1μM的MTX的无核苷酸培养基中选择培养。挑出MTX抗性细胞在MTX浓度不断增加的培养基中选择和扩增。挑出产量最高的细胞，有限稀释进行亚克隆，最后得到理想的克隆细胞。
例6.重组TPO在杆状病毒(Baculovirus)系统中的表达以T1克隆DNA为模板，经PCR反应得到编码全长TPO蛋白的DNA片段。5’-端引物为5’-CCCAGATCTGCCAGAATGGAGCTGAAC-3’含BglII位点及起始密码子。3’-端引物为5’-AAAGGTACCTTACCCTTCCTGAGACAG-3’含Asp718位点及TPO基因3’-端互补序列。扩增片段以BglII及Asp718消化。表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的多角体蛋白强启动子。其后为BamHI及Asp718识别位点。猴病毒SV-40的聚腺苷酸位点用于有效地进行聚腺苷酸化。大肠杆菌(E.coli.)的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同方法插入，随后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。
载体以BamHI及ASP718消化，PCR片段以BglII及Asp718消化后与载体相连接。连接液转化E.coli.XLI BLue经筛选鉴定得到重组体pTPO-4，见图4。
将5ug质粒pTPO-4与1.0ug线性化的杆状病毒DNA(“BaculoGold”，Pharmingen，San Siego，CA)经脂质转染法共转染(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417，1987)。
将1ug Baculo Gold病毒DNA与5ug pTPO-4质粒在50ul无血清Grace’s培养基中混匀，加入10ul Lipofectin及90ulGrace’s培养基，混匀，室温培养15分钟。将转染混合液逐滴加入1ml无血清Grace’s培养基中的Sf9昆虫细胞(ATCCCRL 1711)中。混匀，27℃培养5小时。然后除去转染液，加入1ml含10％胎牛血清(FBS)的Grace’s昆虫培养基。混匀，27℃培养4天。
4天后，将病毒进行一系列稀释进行空斑分析，挑出蓝斑，加入200ul Grace’s培养基中，上清用于感染Sf9细胞。4天后收集上清存于4℃。
Sf9细胞培养于含10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中，然后以重组杆状病毒V-TPO感染，感染复数为2。6小时后去除培养基，加入不含Met及Cys的SF900II培养基(LifeTechnologies，Inc，Gaithersburg)42小时后加入5uCi35S-Met及5uCi-Cys(Amersham)。继续培养16小时，然后收集细胞进行SDS-PAGE及放射自显影分析。
图表说明表1.本发明之TPO的DNA及氨基酸序列表2.本发明之TPO的DNA序列与已发表序列的比较TPO-A本发明之TPO的DNA序列TPO-BFoster等发表的TPO的DNA序列(PNAS，待发表)TPO-Cde Sauvage等发表的TPO的DNA序列(Nature，369533，1994)TPO-DBartley等发表的TPO的DNA序列(Cell，77117，1994)表3.本发明的TPO氨基酸序列与已发表的序列的比较A本发明之TPO的氨基酸序列BJoster等发表的TPO的氨基酸序列Cde Saurage等发表的TPO的氨基酸序列DBartley等发表的TPO的氨基酸序列图1重组体pTPO-1的结构示意2重组体pTPO-2的结构示意3重组体pTPO-3的结构示意4重组体pTPO-4的结构示意图
10 30 50GGAGCCCTTCTCCACCCGGATAGATTCTTCACCCTTGGCCCGCCTTTGCCCCACCCTACT70 90 110CTGCCCAGAAGTGCAAGAGCCTAAGCCGCCTCCATGGCCCCAGGAAGGATTCAGGGGAGA130 150 170GGCCCCAAACAGGGAGCCACGCCAGCCAGACACCCCGGCCAGAATGGAGCTGACTGAATTM E L T E L190 210 230GCTCCTCGCGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCL L A V M L L L T A R L T L S S P A P P250 270 290TGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGA C D L R V L S K L L R D S H V L H S R310 330 350ACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGAL S Q C P E V H P L P T P V L L P A V D370 390 410CTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGF S L G E W K T Q M E E T K A Q D I L G表1
430450AGCACTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGA V T L L L E G V M A A R G Q L G P T C490 510 530CCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAL S S L L G Q L S C Q V R L L L G A L Q550 570 590GAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAAS L L G T Q L P P Q C R T T A H K D P N610 630 650TGCCATCTTCCTGACCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTCATGCTTGTA I F L S F Q H L L R G K V R F L M L V670 690 710AGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACG G S T L C V R R A P P T T A V P S R T730 750770CTCTCTAGTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAAS L V L T L N E L P N R T S G L L E T N790 810 830CTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGCGATTCAGF T A S A R T T G S G L L K W Q Q C F R850 870890AGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATAA K I P G L L N Q T S R G L D Q I P G Y910 930 950CCIGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGL N K I H E L L N G T R G L F P G P S R
970 9901010CACGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCR T L G A P D I G G G T S D T G S L P P10301050 1070CAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTN L Q P G Y S P S P T H P P T G Q Y T L109011101130CTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGAF P L F P T L T T P V V Q L H P L L P D115011701190CCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCP S A P T P T P T S P L L N T S Y T H S12101230 1250CCCGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCAR N L S Q E G *1270 1290 1310TGTACAGCTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTT1330 1350 1370TCTCCTGAAACCCAAAGCCCTGGTAAAAGGGATACACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTT139014101430TCACTGTACATTATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCTATCAGCAATACTCATCAG1450AGCAGCTAAAAAAAAAAAAA 表2 表3
图1质粒pTPO-1结构示意图TPO 编码人血小板生成的DNABglII BglII限制酶切位点6His 6个组氨酸标记Ori 复制起始Amp-r 氨苄青霉素抗性基因Placz 大肠杆菌β-半乳糖苷酶启动子SphI SphI限制酶切位点图2质粒pTPO-2结构示意图TPO 编码人血小板生成的DNAHindIIIHindIII限制酶切位点Ori 复制起始Amp-r 氨苄青霉素抗性基因SphI SphI限制酶切位点Placz 大肠杆菌β-半乳糖苷酶启动子图3质粒pTPO-3结构示意图TPO 编码人血小板生成的DNAPvuII PvuII限制酶切位点DHFR二氢叶酸还原酶基因Ori 复制起始Amp-r 氨苄青霉素抗性基因Pcmv-RSV巨细胞病毒-Rosu肉瘤病毒启动子BamHI BamHI限制酶切位点图4质粒pTPO-4结构示意图TPO 编码人血小板生成素的DNAAsp718Asp718限制酶切位点LacZ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因Ori 复制起始Amp-r 氨苄青霉素抗性基因PpHp 多角体蛋白启动子BamHI BamHI限制酶切位点
权利要求
1．一种编码人血小板生成素的全DNA序列及其编码的氨基酸序列，其特征是该序列包括人血小板生成素的编码区及3’-端和5’-端的非编码区。见下表10 30 50GGAGCCCTTCTCCACCCGGATAGATTCTTCACCCTTGGCCCGCCTTTGCCCCACCCTACT70 90 110CTGCCCAGAAGTGCAAGAGCCTAAGCCGCCTCCATGGCCCCAGGAAGGATTCAGGGGAGA130 150 170GGCCCCAAACAGGGAGCCACGCCAGCCAGACACCCCGGCCAGAATGGAGCTGACTGAATTM E L T E L190 210 230GCTCCTCGCGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCL L A V M L L L T A R L T L S S P A P P250 270 290TGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGA C D L R V L S K L L R D S H V L H S R310 330 350ACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGAL S Q C P E V H P L P T P V L L P A V D370 390 410CTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGF S L G E W K T Q M E E T K A Q D I L G430 450 470AGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGA V T L L L E G V M A A R G Q L G P T C490 510 530CCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAL S S L L G Q L S C Q V R L L L C A L Q550 570 590GAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAAS L L G T Q L P P Q G R T T A H K D P N610630 650TGCCATCTTCCTGACCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTA I F L S F Q H L L R G K V R F L M L V670 690 710AGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACG G S T L C V R R A P P T T A V P S R T730 750770CTCTCTAGTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAAS L V L T L N E L P N R T S G L L E T N790 810 830CTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCACF T A S A R T T G S G L L K W Q Q G F R850 870 890AGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATAA K I P C L L N Q T G R S L D Q I P G Y910 930 950CCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGL N K I H E L L N G T R G L F P G P S R970 9901010CAGGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCR T L G A P D I S S G T S D T C S L T T1030 1050 1070CAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTN L Q P G Y S P S P T H P P T G Q Y T L109011101130CTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGAF P L F P T L P T P V V Q L H P L L P D113011701190CCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCP S A P T P T P T S P L L N T S Y T H G121012301250CCGGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCAR N L S Q E G *12701290 1310TGTACAGCTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTT133013501370TCTCCTGAAACCCAAAGCCCTGGTAAAAGGGATACACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTT139014101430TCACTGTACATTATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCTATCAGCAATACTCATCAG1450AGCAGCTAAAAAAAAAAAAA
2.一种人血小板生成素蛋白，其特征是由权利要求1中的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求2所述的人血小板生成素蛋白，其衍生物是由权利要求1中的全部或部分氨基酸序列组成的多肽或蛋白及其糖基化产物。
4.含有权利要求1中的DNA序列的表达载体。
5.含上述第4条表达载体的宿主细胞，包括细菌、昆虫细胞及哺乳动物细胞。
6.利用上述第5条中含有表达载体的宿主细胞生产上述第2条所述之产物的过程。
7.含有权利要求2或3所述之多肽或蛋白及其衍生物的药品。
全文摘要
本发明涉及一种人造血生长因子，即血小板生成素(TPO)的新结构、基因克隆及其在大肠杆菌、哺乳动物细胞及杆状病毒系统中的表达。从人胎肺中提取mRNA，经逆转录成cDNA文库，经鉴定筛选出TPO的cDNA，再经PCR反应得到的扩增产物与各表达载体相连接，分别用于转化大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、分别得到大肠杆菌、哺乳动物细胞及杆状病毒表达系统。
文档编号C12N15/12GK1127785SQ9511017
公开日1996年7月31日 申请日期1995年4月14日 优先权日1995年4月14日
发明者李维克, 余凯文, 刘竞 申请人:李维克, 余凯文, 刘竞