专利名称：一种重组人肿瘤坏死因子衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗肿瘤的物质，特别是一种肿瘤坏死因子的衍生物。
肿瘤是人类排在心脑血管疾病之后的第二大死因。据估计全世界每年死于各种恶性肿瘤的人数接近1000万。目前，临床上常规治疗肿瘤的方法为手术、化疗及放疗等。对于肿瘤早期患者可采取手术切除合并其它疗法，往往可取得较好的效果，但是对于那些无手术指征的晚期癌症病人，化疗及放疗的效果往往很差，且后两种治疗方法本身具有严重的毒副反应，故众多的医学科学家都致力于找到一种既有高效抗肿瘤作用，又不影响机体正常功能的治疗方法。以细胞因子为基础的肿瘤生物治疗正是在这种情况下诞生和发展的。
在众多的细胞因子中，目前已知唯有肿瘤坏死因子α(Tumer necrosisfacterα，TNFα)可起到直接特异地杀伤肿瘤细胞的作用。故而自TNFα发现后，立刻引起了人们的重视，人们对其在肿瘤治疗中的价值曾寄予了很大的希望。国内外应用重组TNFα(rh-TNFα)临床试用的结果表明，该因子对多种恶性肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，许多患者经过治疗后肿瘤缩小甚至消失，病情缓解，生存期延长，但是亦发现rh-TNFα具有十分明显的毒副反应，如发热、寒战、低血压、体重下降，个别病人甚至可发生严重的休克，故限制了rh-TNFα的临床应用。
本发明的一个目的是提供一种高活性、低毒副作用的重组人肿瘤坏死因子α衍生物。
本发明的另一个目的是提供一种上述衍生物的制备方法。
本发明的重组人肿瘤坏死因子α衍生物(表示为rh-TNFαDlla)的化学结构(氨基酸序列)如下Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln AlaGlu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu AlaAsn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu GlyLeu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val SerTyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys GlnArg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro IleTyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser AlaGlu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln ValTyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe其中Arg为精氨酸，Lys为赖氨酸，Pro为脯氨酸，Val为缬氨酸，Ala为丙氨酸，His为组氨酸，Asn为天冬酰胺，Gln为谷氨酰胺，Glu为谷氨酸，Gly为甘氨酸，Leu为亮氨酸，Trp为色氨酸，Asp为天冬氨酸，Ser为丝氨酸，Tyr为酪氨酸，Ile为异亮氨酸，Phe为苯丙氨酸，Cys为半胱氨酸，Thr为苏氨酸。
本发明的重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备方法为将TNFα分子的第1～7位氨基酸(即Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr)缺失掉，并将第8、9、10位和157位的氨基酸(Pro Ser Asp和Leu)置换为Arg Lys Arg和Phe。
本发明的方法的具体实施方案是将人TNFαCDNA、引物5′GGAA TTCATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT3′、引物5′CG GGATCC TTA TCA GAA AGC AAT GAT ACC AAA3′、dNTP在PCR缓冲液中进行多聚酶联反应，将所得改造后的TNFα基因重组入带有PRRL启动子的原核表达载体PBV220中，得到重组质粒，可在大肠杆菌中表达，得到本发明的衍生物。
本发明所制得的重组人肿瘤坏死因子α衍生物(rh-TNFαDlla)与原型rh-TNFα相比活性高700倍以上，毒性低100倍左右。所以本发明的rh-TNFαDlla活性高、毒性低，可适用于各种恶性肿瘤患者，对肚癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、皮肤癌、胃癌和食管癌等有较好疗效。另外，应用于经手术、化疗、放疗的肿瘤患者，可使机体免疫功能恢复加速，起抗转移、抗复发的作用。
下面通过实施例进一步描述本发明的最佳实施方案。实施例本发明所用的突变引物I为5′GGAA TTC ATG CGT AAA CGT AAGCCT GTA GCC CAT3′，引物II为5′CG GGA TCC TTA TCA GAA AGCAAT GAT ACC AAA3′，取PCR缓冲液(KC150mM，Tris·HCl100mM，MgCl15mM，明胶0.1mg/L)IOμL，2mMdNTP IOμl，引物I100ng，引物II100ng，人TNFαCDNA 80ng，加灭菌水至100μl。混匀后在95℃变性5分钟，加TagDNA聚合酶2.5U，混匀，加石醋油50μl，保持94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分30秒，然后再保持在94℃1分钟，如此进行共30个循环，最后保持在72℃7分钟。将所得改造后的TNFα基因克隆入PUC19载体中，利用双脱氧法进行核苷酸序列分析，结果如下5′GGAA TTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTTGTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTGAAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTGTAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGCTGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGCCGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTCTCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAGGGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTGGGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAGTCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC GGA TCC CG3′其中方框中碱基为起始密码子和终止密码子，划线部分为改造后的密码子。
将改造后的具有正确序列的TNFα基因重组入带有PRPL启动子的原核表达载体PBV220中，得PBVTNFαDlla重组质粒。
所述重组质粒可在大肠杆菌特别是DH5α中表达。一种优选的方案为将以上重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中，挑取一个正确的转化子，经3次划板(在含50μg/ml的琼脂平板上划线)活化，最后挑取一个菌落，在2ml LB培养基中30℃振荡过夜，次日以1％的量接种于200mLB中，30℃培养至OD600＝0.4～0.6时，迅速升温至42℃，快速振摇，热诱导4～6小时，rh-TNFαDlla表达量约占菌体总蛋白量的30％。
下面将rh-TNFαDlla与原型rh-TNFα进行比活性比较分别测定纯化的以上两种蛋白质含量后，采用在放线菌素D存在下，TNF对L929细胞的细胞毒性方法，测定其细胞毒活性，根据所得数据分别计算出比活性，见下表
下面是动物急性毒性实验情况本实验目的是观察一次性剂量rh-TNFαDlla给药后动物表现出的毒性反应，从而确定它的临床应用价值。
初步实验表明5×103IU/kg以下的rh-TNFαDlla注射末出现任何毒副反应；≥6.1×103IU/kg后部分动物发生死亡；≥1.5×109IU/kg后则动物全部致死。说明5×103IU/kg剂量下是安全的。
结论1.rh-TNFαDlla用药剂量在≤5×103IU/kg对小鼠无任何毒副反应，是安全的，此为人体用量的25000倍，据此可以认为rh-TNFαDlla人体内给药亦是安全的。
2.rh-TNFαDlla的毒性比原型(rh-TNFα)低约100倍左右。
3.rh-TNFαDlla对小鼠的LD50为8.6×103IU/kg。
本发明的上述方案仅作为实例给出，本领域技术人员可以根据本发明采用不同的实施方案，但均不脱离本发明的实质和权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种重组人肿瘤坏死因子α衍生物，其特征是化学结构(氨基酸序列)如下Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln AlaGlu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu AlaAsn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu GlyLeu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val SerTyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys GlnArg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro IleTyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser AlaGlu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln ValTyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe
2.一种权利要求1的重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备方法，其特征是将TNFα的第1-7位氨基酸(即Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr)缺失掉，并将第8、9、10位和157位的氨基酸(Pro Ser Asp Asp和Leu)置换为Arg Lus Arg和Phe。
3.如权利要求2的方法，其特征是将人TNFαCDNA、引物5′GGAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT3′、引物5′CGGGA TCC TTA TCA GAA AGC AAT GAT ACC AAA3′、dNTP在PCR缓冲液中进行多聚酶联反应，将所得改造后的TNFα基因重组入带有PRPL启动子的原核表达载体PBV220中。
4.如权利要求3的方法，其特征是将所述重组入PBV220中的改造后的TNFα基因在大肠杆菌中表达。
5.如权利要求4的方法，其特征是所述大肠杆菌为DH5α。
全文摘要
本发明公开了一种重组人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法。本发明将原型TNFα分子的第1-7位氨基酸缺失掉，并将第8、9、10、157位的氨基酸置换为Arg Lus Arg和Phe，所制得的衍生物比活性比原型高720倍，毒性低约100倍，可广泛用于治疗各种恶性肿瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、皮肤癌、胃癌和食道癌等。
文档编号C12N15/28GK1127786SQ95115489
公开日1996年7月31日 申请日期1995年9月18日 优先权日1995年9月18日
发明者刘丽, 王国志, 谢宝树, 冯彪, 冷爱军 申请人:中国人民解放军空军总医院